زندگی در دماهای بالا در شرایط آزمایشگاهی با نانوذرات طلای گرم شده با لیزر مشاهده شد

از بازدید شما از Nature.com سپاسگزاریم. نسخه مرورگری که استفاده می کنید پشتیبانی محدودی از CSS دارد. برای بهترین تجربه، توصیه می کنیم از یک مرورگر به روز شده استفاده کنید (یا حالت سازگاری را در اینترنت اکسپلورر غیرفعال کنید). در عین حال، برای اطمینان از پشتیبانی مداوم، سایت را بدون استایل و جاوا اسکریپت ارائه می کنیم.
ترموفیل ها میکروارگانیسم هایی هستند که در دمای بالا رشد می کنند. مطالعه آنها می تواند اطلاعات ارزشمندی در مورد چگونگی سازگاری زندگی با شرایط شدید ارائه دهد. با این حال، دستیابی به شرایط دمای بالا با میکروسکوپ های نوری معمولی دشوار است. چندین راه حل خانگی مبتنی بر گرمایش الکتریکی مقاومتی موضعی پیشنهاد شده است، اما راه حل تجاری ساده ای وجود ندارد. در این مقاله، ما مفهوم گرمایش لیزر در مقیاس میکرو را بر روی میدان دید میکروسکوپ معرفی می‌کنیم تا دماهای بالا را برای مطالعات ترموفیل فراهم کنیم و در عین حال محیط کاربر را ملایم نگه داریم. گرمایش در مقیاس میکرو با شدت لیزر متوسط ​​را می توان با استفاده از یک بستر پوشش داده شده با نانوذرات طلا به عنوان یک جاذب نور زیست سازگار و کارآمد به دست آورد. اثرات احتمالی جابجایی سیال در مقیاس میکرو، احتباس سلولی، و حرکت ترموفورتیک گریز از مرکز مورد بحث قرار گرفته است. این روش در دو گونه نشان داده شده است: (1) Geobacillus stearothermophilus، یک باکتری گرمادوست فعال که در حدود 65 درجه سانتیگراد تولید مثل می کند، که ما مشاهده کرده ایم که جوانه می زند، رشد می کند و تحت حرارت میکروسکوپ شنا می کند. (ii) تیوباسیلوس sp.، باستانی بهینه هایپرترموفیل. در 80 درجه سانتی گراد این کار راه را برای مشاهده ساده و ایمن میکروارگانیسم های گرمادوست با استفاده از ابزارهای میکروسکوپی مدرن و مقرون به صرفه هموار می کند.
طی میلیاردها سال، زندگی روی زمین برای انطباق با طیف وسیعی از شرایط محیطی تکامل یافته است که گاهی اوقات از دیدگاه انسانی ما بسیار شدید تلقی می شوند. به طور خاص، برخی از میکروارگانیسم‌های گرما دوست (باکتری‌ها، باستان‌ها، قارچ‌ها) به نام گرما دوست در محدوده دمایی از 45 درجه سانتی‌گراد تا 122 درجه سانتی‌گراد رشد می‌کنند. یا مناطق آتشفشانی تحقیقات آنها در چند دهه گذشته حداقل به دو دلیل مورد توجه بسیاری قرار گرفته است. اول، ما می‌توانیم از آنها یاد بگیریم، برای مثال، چگونه ترموفیل‌های 5، 6، آنزیم‌های 7، 8 و غشاهای 9 در چنین دماهای بالا پایدار هستند، یا چگونه ترموفیل‌ها می‌توانند سطوح شدید تشعشع را تحمل کنند. دوم، آنها اساس بسیاری از کاربردهای مهم بیوتکنولوژیکی هستند1،11،12 مانند تولید سوخت13،14،15،16، سنتز شیمیایی (دی هیدرو، الکل ها، متان، اسیدهای آمینه و غیره)17، بیومینینگ18 و زیست کاتالیست های مقاوم در برابر حرارت7،11، 13. به طور خاص، واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR)19 که در حال حاضر شناخته شده است، شامل یک آنزیم (Taq polymerase) جدا شده از باکتری گرمادوست Thermus aquaticus، یکی از اولین گرمادوست هایی است که کشف شد.
با این حال، مطالعه ترموفیل ها کار ساده ای نیست و نمی توان آن را در هیچ آزمایشگاه بیولوژیکی بداهه ساخت. به ویژه، ترموفیل‌های زنده را نمی‌توان در شرایط آزمایشگاهی با هیچ میکروسکوپ نوری استاندارد مشاهده کرد، حتی با اتاق‌های گرمایش تجاری موجود، که معمولاً برای دمای پایین‌تر از 40 درجه سانتی‌گراد درجه‌بندی می‌شوند. از دهه 1990، تنها چند گروه تحقیقاتی خود را به معرفی سیستم‌های میکروسکوپ با دمای بالا (HTM) اختصاص داده‌اند. در سال 1994 گلوخ و همکاران. محفظه گرمایش/خنک کننده بر اساس استفاده از یک سلول Peltier که دمای مویرگ های مستطیلی بسته را برای حفظ بی هوازی بودن کنترل می کند، طراحی شد. این دستگاه را می توان تا 100 درجه سانتیگراد با سرعت 2 درجه سانتیگراد در ثانیه گرم کرد و به نویسندگان اجازه می دهد تا تحرک باکتری هایپرترموفیل Thermotoga maritima21 را مطالعه کنند. در سال 1999 هورن و همکاران. دستگاه بسیار مشابهی ساخته شده است که هنوز بر اساس استفاده از مویرگ های گرم شده مناسب برای میکروسکوپ تجاری برای مطالعه تقسیم/اتصال سلولی است. پس از یک دوره طولانی عدم فعالیت نسبی، جستجو برای HTM های موثر در سال 2012 از سر گرفته شد، به ویژه در رابطه با یک سری مقالات توسط گروه Wirth که از دستگاهی اختراع شده توسط Horn و همکاران استفاده می کرد. پانزده سال پیش، تحرک تعداد زیادی از باستان‌ها، از جمله هیپرترموفیل‌ها، در دماهای تا 100 درجه سانتی‌گراد با استفاده از مویرگ‌های گرم شده مورد مطالعه قرار گرفت23،24. آنها همچنین میکروسکوپ اصلی را برای دستیابی به گرمایش سریعتر (چند دقیقه به جای 35 دقیقه برای رسیدن به دمای تنظیم شده) و دستیابی به گرادیان دمایی خطی بیش از 2 سانتی متر در سطح محیط تغییر دادند. این دستگاه شکل دهی گرادیان دما (TGFD) برای مطالعه تحرک بسیاری از ترموفیل ها در شیب دما در فواصل بیولوژیکی مرتبط استفاده شده است 24، 25.
گرم کردن مویرگ های بسته تنها راه مشاهده ترموفیل های زنده نیست. در سال 2012، کوابارا و همکاران. محفظه های یکبار مصرف خانگی Pyrex مهر و موم شده با چسب مقاوم در برابر حرارت (Super X2؛ Cemedine، ژاپن) استفاده شد. نمونه ها روی یک صفحه گرمایش شفاف تجاری موجود (Micro Heat Plate، Kitazato Corporation، ژاپن) قرار گرفتند که می تواند تا دمای 110 درجه سانتیگراد گرم شود، اما در اصل برای تصویربرداری زیستی در نظر گرفته نشده بود. نویسندگان تقسیم کارآمد باکتری های گرمادوست بی هوازی (Thermosipho globiformans، زمان دو برابر شدن 24 دقیقه) را در دمای 65 درجه سانتی گراد مشاهده کردند. در سال 2020، پولشن و همکاران. گرم کردن کارآمد ظروف فلزی تجاری (AttofluorTM، Thermofisher) با استفاده از دو عنصر گرمایش خانگی نشان داده شد: یک درب و یک مرحله (پیکربندی الهام گرفته از دستگاه PCR). این ارتباط باعث ایجاد دمای مایع یکنواخت می شود و از تبخیر و تراکم در پایین درب جلوگیری می کند. استفاده از O-ring از تبادل گاز با محیط جلوگیری می کند. این HTM که سولفوسکوپ نام دارد برای تصویربرداری از Sulfolobus acidocaldarius در دمای 75 درجه سانتیگراد استفاده شد.
محدودیت شناخته شده همه این سیستم ها محدودیت استفاده از اهداف هوا بود، هر گونه غوطه وری در روغن برای چنین دمای بالایی و برای تصویربرداری از نمونه های شفاف ضخامت بیش از 1 میلی متر مناسب نیست. محدودیت شناخته شده همه این سیستم ها محدودیت استفاده از اهداف هوا بود، هر گونه غوطه وری در روغن برای چنین دمای بالایی و برای تصویربرداری از نمونه های شفاف ضخامت بیش از 1 میلی متر مناسب نیست. Общепризнанным недостатокм всех этих систем было ограничено на использование воздушных объективов, поскольку любое иммерсионное погружение во масло не подходило для такой высокизущене температуры и для рез 1 میلی متر نقص شناخته شده همه این سیستم ها محدودیت در استفاده از اهداف هوا بود، زیرا هرگونه غوطه وری در روغن برای چنین دمای بالایی و برای تجسم از طریق نمونه های شفاف با ضخامت بیش از 1 میلی متر مناسب نبود.所有这些系统的一个公认限制是限制使用空气物镜，任何油浸都不适合迿限制是限制使用空气物镜，任何油浸都不适合连毫米厚的透明样品成像. محدودیت شناخته شده همه این سیستم ها محدودیت استفاده از یک آینه با هوا است، زیرا هرگونه غوطه وری در روغن برای تصویربرداری از نمونه های شفاف با ضخامت بیش از 1 میلی متر در چنین دماهای بالایی نامناسب است. همه این سیستم ها محدود به استفاده از هوای غیرمجاز هستند. یک اشکال شناخته شده همه این سیستم ها استفاده محدود از لنزهای هوا است، هرگونه غوطه وری در روغن برای چنین دماهای بالا و تجسم از طریق نمونه های شفاف ضخامت بیش از 1 میلی متر نامناسب است.اخیراً، این محدودیت توسط چارلز-اورزاگ و همکاران برداشته شد. 28، که دستگاهی را توسعه داد که دیگر گرما را در اطراف سیستم مورد نظر فراهم نمی کند، بلکه در داخل خود شیشه پوشش، با یک لایه شفاف نازک از مقاومت ساخته شده از ITO (اکسید قلع ایندیوم) پوشیده شده است. با عبور جریان الکتریکی از لایه شفاف می توان درب را تا دمای 75 درجه سانتی گراد گرم کرد. با این حال، نویسنده باید لنز را تا شیئی نیز گرم کند، اما نه بیشتر از 65 درجه سانتیگراد، تا آسیبی به آن وارد نشود.
این کارها نشان می‌دهد که توسعه میکروسکوپ نوری با دمای بالا به طور گسترده مورد پذیرش قرار نگرفته است، اغلب به تجهیزات خانگی نیاز دارد، و اغلب به قیمت تفکیک مکانی به دست می‌آید، که با توجه به اینکه میکروارگانیسم‌های گرما دوست بزرگ‌تر از تعداد کمی نیستند، یک ضرر جدی است. میکرومتر کاهش حجم گرمایش کلید حل سه مشکل ذاتی HTM است: وضوح فضایی ضعیف، اینرسی حرارتی بالا هنگام گرم شدن سیستم، و گرمایش مضر عناصر اطراف (روغن غوطه‌ور، عدسی‌های شیئی... یا دست‌های کاربر) در دماهای شدید. ).
در این مقاله، ما یک HTM را برای مشاهده ترموفیل معرفی می کنیم که مبتنی بر گرمایش مقاومتی نیست. در عوض، ما به گرمایش موضعی در یک منطقه محدود از میدان دید میکروسکوپ با تابش لیزر از یک بستر جذب کننده نور دست یافتیم. توزیع دما با استفاده از میکروسکوپ فاز کمی (QPM) مشاهده شد. اثربخشی این روش توسط Geobacillus stearothermophilus، یک باکتری گرمادوست متحرک که در حدود 65 درجه سانتیگراد تکثیر می شود و زمان دو برابر شدن کوتاهی دارد (حدود 20 دقیقه) و Sulfolobus shibatae، یک هیپرترموفیل که در دمای 80 درجه سانتیگراد به طور بهینه رشد می کند (archae) نشان داده شده است. برای نشان دادن سرعت تکثیر طبیعی و شنا به عنوان تابعی از دما مشاهده شد. این لیزر HTM (LA-HTM) با ضخامت پوشش یا ماهیت هدف (غوطه وری در هوا یا روغن) محدود نمی شود. این اجازه می دهد تا از هر لنز با وضوح بالا در بازار استفاده شود. همچنین به دلیل اینرسی حرارتی از گرمایش آهسته رنج نمی برد (در مقیاس میلی ثانیه به گرمایش فوری می رسد) و فقط از قطعات موجود تجاری استفاده می کند. تنها نگرانی های ایمنی جدید مربوط به وجود پرتوهای لیزر قدرتمند (معمولاً تا 100 مگاوات) در داخل دستگاه و احتمالاً از طریق چشم است که نیاز به عینک محافظ دارد.
اصل LA-HTM استفاده از لیزر برای گرم کردن نمونه به صورت موضعی در میدان دید میکروسکوپ است (شکل 1a). برای انجام این کار، نمونه باید جذب نور باشد. برای استفاده از توان لیزر معقول (کمتر از 100 مگاوات)، ما به جذب نور توسط محیط مایع متکی نبودیم، بلکه به طور مصنوعی با پوشش دادن زیرلایه با نانوذرات طلا، جذب نمونه را افزایش دادیم (شکل 1c). گرم کردن نانوذرات طلا با نور از اهمیت اساسی در زمینه پلاسمونیک حرارتی با کاربردهای مورد انتظار در زیست پزشکی، نانوشیمی یا برداشت نور خورشید برخوردار است 29،30،31. در چند سال گذشته، ما از این LA-HTM در چندین مطالعه مرتبط با کاربردهای پلاسمای حرارتی در فیزیک، شیمی و زیست شناسی استفاده کرده ایم. مشکل اصلی این روش در نمایش مشخصات دمای نهایی است، زیرا دمای بالا به یک منطقه میکرو مقیاس در نمونه محدود می شود. ما نشان دادیم که نگاشت دما را می توان با تداخل سنج برشی عرضی چهار طول موج، یک روش ساده، با وضوح بالا و بسیار حساس میکروسکوپ فاز کمی بر اساس استفاده از گریتینگ های پراش دو بعدی (همچنین به عنوان گریتینگ متقاطع شناخته می شود) به دست آورد. 33,34,35,36. قابلیت اطمینان این تکنیک میکروسکوپ حرارتی، بر اساس میکروسکوپ جبهه موج گریتینگ متقاطع (CGM)، در ده‌ها مقاله منتشر شده در دهه گذشته نشان داده شده است 37،38،39،40،41،42،43.
طرح نصب لیزر موازی گرمایش، شکل دهی و میکروسکوپ دما. b هندسه نمونه متشکل از یک محفظه AttofluorTM حاوی یک ورقه پوششی پوشیده شده با نانوذرات طلا. c به دقت به نمونه نگاه کنید (نه به مقیاس). d نمایانگر یکنواخت پرتو لیزر و (e) توزیع دمای بعدی شبیه سازی شده در صفحه نمونه نانوذرات طلا است. f یک پروفیل پرتو لیزر حلقوی مناسب برای تولید دمای یکنواخت است که در شبیه سازی توزیع دمای حاصل نشان داده شده در (g) نشان داده شده است. نوار مقیاس: 30 میکرومتر.
به طور خاص، ما اخیراً به گرم کردن سلول‌های پستانداران با LA-HTM و CGM دست یافته‌ایم و پاسخ‌های شوک حرارتی سلولی را در محدوده 37-42 درجه سانتی‌گراد ردیابی کردیم، که کاربرد این تکنیک را برای تصویربرداری تک سلولی زنده نشان می‌دهد. با این حال، استفاده از LA-HTM برای مطالعه میکروارگانیسم‌ها در دماهای بالا بدون ابهام نیست، زیرا در مقایسه با سلول‌های پستانداران به احتیاط بیشتری نیاز دارد: اولاً، گرم کردن پایین محیط با ده‌ها درجه (به جای چند درجه) منجر می‌شود. به یک گرادیان درجه حرارت عمودی قوی. می تواند همرفت سیال 44 را ایجاد کند که اگر محکم به زیرلایه نچسبد، می تواند باعث حرکت نامطلوب و اختلاط باکتری ها شود. این همرفت را می توان با کاهش ضخامت لایه مایع از بین برد. برای این منظور، در تمام آزمایش‌های ارائه‌شده در زیر، سوسپانسیون‌های باکتریایی بین دو ورقه پوششی با ضخامت تقریبی 15 میکرومتر در داخل یک فنجان فلزی قرار داده شدند (AttofluorTM، Thermofisher، شکل 1b،c). در اصل، اگر ضخامت مایع کوچکتر از اندازه پرتو لیزر گرمایش باشد، می توان از همرفت اجتناب کرد. ثانیا، کار در چنین هندسه محدودی می تواند موجودات هوازی را خفه کند (شکل S2 را ببینید). این مشکل را می توان با استفاده از بستری که در برابر اکسیژن (یا هر گاز حیاتی دیگر) نفوذپذیر است، با باقی گذاشتن حباب های هوای محبوس شده در داخل ورقه پوششی، یا با سوراخ کردن سوراخ هایی در لایه پوششی بالایی (نگاه کنید به شکل S1) اجتناب کرد. در این مطالعه، ما راه حل دوم را انتخاب کردیم (شکل 1b و S1). در نهایت، حرارت لیزر توزیع یکنواخت دما را فراهم نمی کند. حتی در همان شدت پرتو لیزر (شکل 1d)، توزیع دما یکنواخت نیست، بلکه به دلیل انتشار حرارتی به توزیع گاوسی شباهت دارد (شکل 1e). هنگامی که هدف ایجاد دماهای دقیق در میدان دید برای مطالعه سیستم‌های بیولوژیکی است، پروفایل‌های ناهموار ایده‌آل نیستند و همچنین می‌توانند منجر به حرکت حرارتی باکتری‌ها در صورت عدم چسبیدن به بستر شوند (شکل S3، S4 را ببینید)39. برای این منظور، ما از یک مدولاتور نور فضایی (SLM) برای شکل دادن به پرتو لیزر مادون قرمز مطابق با شکل حلقه (شکل 1f) در صفحه نمونه استفاده کردیم تا به توزیع دمای کاملاً یکنواخت در یک منطقه هندسی معین دست یابیم. علیرغم انتشار حرارتی (شکل 1d) 39، 42، 46. برای جلوگیری از تبخیر محیط، یک ورقه رویی روی یک ظرف فلزی قرار دهید (شکل 1b) و حداقل برای چند روز آن را مشاهده کنید. از آنجایی که این روکش رویی مهر و موم نشده است، در صورت لزوم می توان به راحتی در هر زمان به آن محیط اضافی اضافه کرد.
برای نشان دادن نحوه عملکرد LA-HTM و نشان دادن کاربرد آن در تحقیقات گرمادوست، ما باکتری هوازی Geobacillus stearothermophilus را مورد مطالعه قرار دادیم که دمای رشد بهینه آنها در حدود 60-65 درجه سانتیگراد است. این باکتری همچنین دارای تاژک و توانایی شنا است که نشانگر دیگری از فعالیت طبیعی سلولی است.
نمونه ها (شکل 1b) از قبل در دمای 60 درجه سانتی گراد به مدت یک ساعت انکوبه شدند و سپس در نگهدارنده نمونه LA-HTM قرار گرفتند. این پیش جوجه کشی اختیاری است، اما هنوز مفید است، به دو دلیل: اول، هنگامی که لیزر روشن می شود، باعث می شود سلول ها بلافاصله رشد کرده و تقسیم شوند (به فیلم M1 در مواد تکمیلی مراجعه کنید). بدون قبل از جوجه کشی، رشد باکتری معمولاً با هر بار گرم شدن یک ناحیه مشاهده جدید روی نمونه حدود 40 دقیقه به تاخیر می افتد. دوم، 1 ساعت قبل از جوجه کشی باعث افزایش چسبندگی باکتری ها به لایه پوششی شد و از بیرون رفتن سلول ها از میدان دید به دلیل گرماسازی در هنگام روشن شدن لیزر جلوگیری کرد (به فیلم M2 در مواد تکمیلی مراجعه کنید). ترموفورز حرکت ذرات یا مولکول ها در امتداد گرادیان دما است، معمولاً از گرم به سرد، و باکتری ها نیز از این قاعده مستثنی نیستند43،47. این اثر نامطلوب در یک منطقه معین با استفاده از SLM برای شکل دادن به پرتو لیزر و دستیابی به توزیع دمای صاف حذف می شود.
روی انجیر شکل 2 توزیع دمای اندازه گیری شده توسط CGM را نشان می دهد که با تابش یک بستر شیشه ای پوشیده شده با نانوذرات طلا با پرتو لیزر حلقوی به دست آمده است (شکل 1f). توزیع دمای صاف در کل منطقه تحت پوشش پرتو لیزر مشاهده شد. این منطقه روی 65 درجه سانتی گراد، دمای مطلوب رشد تنظیم شد. در خارج از این ناحیه، منحنی دما به طور طبیعی به \(1/r\) می رسد (که \(r\) مختصات شعاعی است).
یک نقشه دمایی از اندازه‌گیری‌های CGM که با استفاده از یک پرتو لیزر حلقوی برای تابش لایه‌ای از نانوذرات طلا برای به دست آوردن مشخصات دمایی مسطح در یک ناحیه دایره‌ای به دست آمده است. b ایزوترم نقشه دما (a). کانتور پرتو لیزر با یک دایره نقطه‌دار خاکستری نشان داده می‌شود. آزمایش دو بار تکرار شد (مواد تکمیلی، شکل S4 را ببینید).
زنده ماندن سلول های باکتریایی برای چند ساعت با استفاده از LA-HTM بررسی شد. روی انجیر 3 فاصله زمانی چهار تصویر گرفته شده از یک فیلم 3 ساعت و 20 دقیقه را نشان می دهد (فیلم M3، اطلاعات تکمیلی). مشاهده شد که باکتری‌ها به طور فعال در ناحیه دایره‌ای که توسط لیزر تعریف شده است، تکثیر می‌شوند، جایی که دمای آن به 65 درجه سانتیگراد نزدیک می‌شود. در مقابل، زمانی که دما به مدت 10 ثانیه به زیر 50 درجه سانتی گراد رسید، رشد سلولی به طور قابل توجهی کاهش یافت.
تصاویر عمق نوری باکتری G. stearothermophilus در حال رشد پس از حرارت لیزر در زمان های مختلف، (الف) t = 0 دقیقه، (ب) 1 ساعت و 10 دقیقه، (ج) 2 ساعت و 20 دقیقه، (د) 3 ساعت و 20 دقیقه، از 200 استخراج شده از یک فیلم یک دقیقه ای (فیلم M3 ارائه شده در اطلاعات تکمیلی) که بر روی نقشه دمای مربوطه قرار گرفته است. لیزر در زمان \(t=0\) روشن می شود. ایزوترم به تصویر شدت اضافه شده است.
برای تعیین کمیت بیشتر رشد سلولی و وابستگی آن به دما، افزایش زیست توده کلنی های مختلف باکتری های جدا شده اولیه را در میدان دید Movie M3 اندازه گیری کردیم (شکل 4). باکتری های والد انتخاب شده در شروع تشکیل واحد تشکیل کلونی کوچک (mCFU) در شکل S6 نشان داده شده است. اندازه گیری جرم خشک با دوربین CGM 48 که برای نقشه توزیع دما مورد استفاده قرار گرفت، گرفته شد. توانایی CGM برای اندازه گیری وزن خشک و دما، قدرت LA-HTM است. همانطور که انتظار می رفت، دمای بالا باعث رشد سریعتر باکتری شد (شکل 4a). همانطور که در نمودار نیمه لاگ در شکل 4b نشان داده شده است، رشد در همه دماها از رشد نمایی پیروی می کند، جایی که داده ها از تابع نمایی \(m={m}_{0}{10}^{t/\ tau }+ استفاده می کنند. {{ \mbox{cst}}}\), جایی که \(\tau {{{{{\rm{log }}}}}}2\) – زمان تولید (یا زمان دو برابر شدن)، \(g =1/ \tau\) – نرخ رشد (تعداد تقسیمات در واحد زمان). روی انجیر 4c نرخ رشد و زمان تولید مربوطه را به عنوان تابعی از دما نشان می دهد. mCFUهای سریع رشد با اشباع شدن رشد پس از دو ساعت مشخص می شوند، یک رفتار مورد انتظار به دلیل چگالی باکتریایی بالا (شبیه به فاز ساکن در کشت های مایع کلاسیک). شکل کلی \(g\left(T\right)\) (شکل 4c) مطابق با منحنی دو فازی مورد انتظار برای G. stearothermophilus با نرخ رشد بهینه در حدود 60-65 درجه سانتیگراد است. داده ها را با استفاده از یک مدل اصلی (شکل S5) 49 مطابقت دهید که در آن \(\left({{G}_{0}{;\;T}}_{{\min }};{T}_{{opt} } ;{T}_{{\max}}\right)\) = (0.2 ± 0.70؛ 4 ± 40؛ 1.6 ± 65؛ 3 ± 67) درجه سانتی گراد، که به خوبی با سایر مقادیر ذکر شده در ادبیات مطابقت دارد. اگرچه پارامترهای وابسته به دما قابل تکرار هستند، حداکثر نرخ رشد \({G}_{0}\) ممکن است از آزمایشی به آزمایش دیگر متفاوت باشد (شکل S7-S9 و فیلم M4 را ببینید). بر خلاف پارامترهای تناسب دما، که باید جهانی باشند، حداکثر نرخ رشد به خواص محیط (در دسترس بودن مواد مغذی، غلظت اکسیژن) در هندسه میکرومقیاس مشاهده شده بستگی دارد.
رشد میکروبی در دماهای مختلف mCFU: واحدهای تشکیل دهنده کلونی مینیاتوری. داده‌های به‌دست‌آمده از ویدئویی از رشد یک باکتری در یک گرادیان دما (فیلم M3). b مشابه (a)، مقیاس نیمه لگاریتمی. c نرخ رشد\(\tau\) و زمان تولید\(g\) از رگرسیون خطی (b) محاسبه می شود. نوارهای خطای افقی: محدوده دمایی که mCFUها در طول رشد به میدان دید گسترش می یابند. نوارهای خطای عمودی: خطای استاندارد رگرسیون خطی.
علاوه بر رشد طبیعی، برخی از باکتری‌ها گاهی اوقات در حین گرمایش لیزری در معرض دید قرار می‌گیرند، که یک رفتار مورد انتظار برای باکتری‌های دارای تاژک است. فیلم M5 در اطلاعات تکمیلی این گونه فعالیت های شنا را نشان می دهد. در این آزمایش از تابش لیزر یکنواخت برای ایجاد یک گرادیان دما استفاده شد، همانطور که در شکل 1d، e و S3 نشان داده شده است. شکل 5 دو توالی تصویر انتخاب شده از فیلم M5 را نشان می دهد که نشان می دهد یک باکتری حرکت جهت دار را نشان می دهد در حالی که سایر باکتری ها بی حرکت می مانند.
دو فریم زمانی (الف) و (ب) شنای دو باکتری مختلف را نشان می دهد که با دایره های نقطه چین مشخص شده اند. تصاویر از فیلم M5 (به عنوان مطالب تکمیلی ارائه شده) استخراج شده است.
در مورد G. stearothermophilus، حرکت فعال باکتری ها (شکل 5) چند ثانیه پس از روشن شدن پرتو لیزر آغاز شد. این مشاهدات بر پاسخ زمانی این میکروارگانیسم ترموفیل به افزایش دما تأکید می کند، همانطور که قبلاً توسط Mora و همکاران مشاهده شده است. 24 . موضوع تحرک باکتری ها و حتی ترموتاکسی را می توان با استفاده از LA-HTM بیشتر مورد بررسی قرار داد.
شنای میکروبی را نباید با سایر انواع حرکت فیزیکی اشتباه گرفت، یعنی (1) حرکت براونی، که به نظر می رسد حرکتی آشفته و بدون جهت مشخص است، (2) همرفت 50 و ترموفورز 43، که شامل یک حرکت منظم حرکت در طول یک دما است. گرادیان
G. stearothermophilus به دلیل توانایی خود در تولید هاگ های بسیار مقاوم (تشکیل اسپور) در هنگام قرار گرفتن در معرض شرایط محیطی نامطلوب به عنوان یک دفاع شناخته شده است. وقتی شرایط محیطی دوباره مساعد شد، هاگ ها جوانه می زنند و سلول های زنده را تشکیل می دهند و رشد را از سر می گیرند. اگرچه این فرآیند اسپورزایی/جوانه زنی به خوبی شناخته شده است، اما هرگز در زمان واقعی مشاهده نشده است. با استفاده از LA-HTM، ما در اینجا اولین مشاهده رویدادهای جوانه زنی در G. stearothermophilus را گزارش می کنیم.
روی انجیر 6a تصاویری با گذشت زمان از عمق نوری (OT) را نشان می دهد که با استفاده از یک مجموعه CGM از 13 هاگ به دست آمده است. برای کل زمان جمع آوری (15 ساعت و 6 دقیقه، \(t=0\) – آغاز گرمایش لیزری)، 4 هاگ از 13 هاگ جوانه زدند، در نقاط زمانی متوالی \(t=2\) ساعت، \(3\ ) h \(10 \)'، \(9\) h \(40\)' و \(11\) h \(30\)'. اگرچه تنها یکی از این رویدادها در شکل 6 نشان داده شده است، 4 رویداد جوانه زنی را می توان در فیلم M6 در مواد تکمیلی مشاهده کرد. جالب اینجاست که جوانه زنی تصادفی به نظر می رسد: علیرغم تغییرات یکسان در شرایط محیطی، همه هاگ ها جوانه نمی زنند و در یک زمان جوانه نمی زنند.
یک تایم لپس متشکل از 8 تصویر OT (غوطه وری در روغن، 60x، هدف NA 1.25) و (ب) تکامل زیست توده از دانه های G. stearothermophilus. ج (ب) برای برجسته کردن خطی بودن نرخ رشد (خط چین) در مقیاس نیمه لگی ترسیم شده است.
روی انجیر 6b,c زیست توده جمعیت های سلولی را در میدان دید به عنوان تابعی از زمان در کل دوره جمع آوری داده ها نشان می دهد. فروپاشی سریع توده خشک در \(t=5\)h در شکل. 6b، c، به دلیل خروج برخی از سلول ها از میدان دید. نرخ رشد این چهار رویداد \(0.77\pm 0.1\) h-1 است. این مقدار بالاتر از نرخ رشد مرتبط با شکل 3. 3 و 4 است، جایی که سلول ها به طور طبیعی رشد می کنند. دلیل افزایش نرخ رشد G. stearothermophilus از اسپورها نامشخص است، اما این اندازه‌گیری‌ها علاقه LA-HTM را برجسته می‌کند و در سطح تک سلولی (یا در سطح تک سلولی) برای کسب اطلاعات بیشتر در مورد پویایی زندگی سلولی کار می‌کند. .
برای نشان دادن بیشتر تطبیق پذیری LA-HTM و عملکرد آن در دماهای بالا، ما رشد Sulfolobus shibatae، یک باستان اسیدوفیل هیپرترموفیل با دمای رشد بهینه 80 درجه سانتی گراد را بررسی کردیم. در مقایسه با G. stearothermophilus، این باستان‌ها مورفولوژی بسیار متفاوتی دارند و به جای میله‌های دراز (باسیل) شبیه کره‌های 1 میکرونی (کوکسی) هستند.
شکل 7a شامل تصاویر عمق نوری متوالی از S. shibatae mCFU است که با استفاده از CGM به دست آمده است (فیلم برجسته M7 را در مواد تکمیلی ببینید). این mCFU در حدود 73 درجه سانتی گراد، زیر دمای بهینه 80 درجه سانتی گراد، اما در محدوده دمایی برای رشد فعال رشد می کند. ما چندین رویداد شکافت را مشاهده کردیم که باعث شد mCFU ها بعد از چند ساعت شبیه ریز انگورهای باستانی به نظر برسند. از این تصاویر OT، زیست توده mCFU در طول زمان اندازه‌گیری شد و در شکل 7b ارائه شد. جالب توجه است، mCFUs S. shibatae رشد خطی را به جای رشد نمایی که با mCFUs G. stearothermophilus مشاهده می‌شود، نشان داد. بحث طولانی مدتی در مورد ماهیت سرعت رشد سلولی وجود داشته است: در حالی که برخی مطالعات نرخ رشد میکروب ها را گزارش می کنند که متناسب با اندازه آنها است (رشد تصاعدی)، برخی دیگر نرخ ثابتی (رشد خطی یا دوخطی) را نشان می دهند. همانطور که توسط Tzur و همکارانش توضیح داده شد، تمایز بین رشد نمایی و (دو)خطی نیاز به دقت کمتر از 6% در اندازه‌گیری‌های زیست توده دارد که برای اکثر تکنیک‌های QPM، حتی شامل تداخل سنجی، دور از دسترس است. همانطور که توسط Tzur و همکارانش توضیح داده شد، تمایز بین رشد نمایی و (دو)خطی نیاز به دقت کمتر از 6% در اندازه‌گیری‌های زیست توده دارد که برای اکثر تکنیک‌های QPM، حتی شامل تداخل سنجی، دور از دسترس است. چه بسا رنگ قرمز و سایر موارد 53، متفاوت باشد. همانطور که توسط Zur و همکاران توضیح داده شد، تمایز بین رشد نمایی و (دو)خطی نیاز به دقت کمتر از 6% در اندازه‌گیری‌های زیست توده دارد که برای اکثر روش‌های QPM، حتی با استفاده از تداخل سنجی، دست نیافتنی است.همانطور که توسط زور و همکاران توضیح داده شده است. 53، تمایز بین رشد نمایی و (دو) خطی به دقت کمتر از 6 درصد در اندازه‌گیری‌های زیست توده نیاز دارد که برای اکثر روش‌های QPM دست نیافتنی است، حتی زمانی که از تداخل سنجی استفاده می‌شود. CGM این دقت را با دقت زیر pg در اندازه گیری های زیست توده به دست می آورد 36،48.
یک تایم لپس متشکل از 6 تصویر OT (غوطه وری در روغن، 60x، هدف NA 1.25) و (ب) تکامل زیست توده میکرو CFU اندازه گیری شده با CGM. برای اطلاعات بیشتر به فیلم M7 مراجعه کنید.
رشد کاملا خطی S. shibatae غیر منتظره بود و هنوز گزارش نشده است. با این حال، رشد تصاعدی انتظار می رود، حداقل به این دلیل که در طول زمان، تقسیم های متعدد سلول های 2، 4، 8، 16 ... باید رخ دهد. ما فرض کردیم که رشد خطی ممکن است به دلیل مهار سلولی به دلیل بسته بندی سلولی متراکم باشد، درست همانطور که رشد سلولی کند می شود و در نهایت زمانی که تراکم سلولی خیلی زیاد است به حالت خاموش می رسد.
ما با بحث در مورد پنج نکته جالب زیر به نوبه خود نتیجه گیری می کنیم: کاهش حجم گرمایش، کاهش اینرسی حرارتی، علاقه به نانوذرات طلا، علاقه به میکروسکوپ فاز کمی، و محدوده دمایی احتمالی که می توان از LA-HTM در آن استفاده کرد.
در مقایسه با گرمایش مقاومتی، گرمایش لیزری که برای توسعه HTM استفاده می‌شود، چندین مزیت را ارائه می‌دهد که در این مطالعه آنها را نشان می‌دهیم. به طور خاص، در محیط های مایع در میدان دید میکروسکوپ، حجم گرمایش در چند (10 میکرومتر) 3 حجم نگهداری می شود. به این ترتیب، تنها میکروب های مشاهده شده فعال هستند، در حالی که باکتری های دیگر خفته هستند و می توان از آنها برای مطالعه بیشتر نمونه استفاده کرد - هر بار که نیاز به بررسی دمای جدید است، نیازی به تغییر نمونه نیست. علاوه بر این، گرمایش در مقیاس میکرو امکان بررسی مستقیم طیف وسیعی از دماها را فراهم می کند: شکل 4c از یک فیلم 3 ساعته (فیلم M3) به دست آمده است، که معمولاً نیاز به آماده سازی و بررسی چندین نمونه دارد - یکی برای هر یک از نمونه های مورد مطالعه. y دمایی است که تعداد روزهای آزمایش را نشان می دهد. کاهش حجم گرم شده همچنین تمام اجزای نوری اطراف میکروسکوپ، به ویژه عدسی شیئی را در دمای اتاق نگه می‌دارد، که تا کنون مشکل بزرگی برای جامعه بوده است. LA-HTM را می توان با هر لنزی از جمله لنزهای غوطه ور در روغن استفاده کرد و حتی با دمای شدید در میدان دید در دمای اتاق باقی می ماند. محدودیت اصلی روش گرمایش لیزری که در این مطالعه گزارش می‌کنیم این است که سلول‌هایی که نمی‌چسبند یا شناور نمی‌شوند، ممکن است از میدان دید دور باشند و مطالعه آنها دشوار باشد. یک راه حل می تواند استفاده از لنزهای با بزرگنمایی کم برای دستیابی به افزایش دما بیشتر از چند صد میکرون باشد. این احتیاط با کاهش قدرت تفکیک مکانی همراه است، اما اگر هدف مطالعه حرکت میکروارگانیسم ها باشد، قدرت تفکیک مکانی بالا لازم نیست.
مقیاس زمانی برای گرم کردن (و سرمایش) سیستم \({{{{\rm{\tau }}}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}\) به اندازه آن بستگی دارد. طبق قانون \({{{({\rm{\tau }}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}={L}^{2}/D\)، جایی که \ (L\) اندازه مشخصه منبع گرما است (قطر پرتو لیزر در مطالعه ما \(L\ حدود 100\) میکرومتر است)، \(D\) انتشار حرارتی محیط است (متوسط ​​در ما سرعت انتشار مورد، لیوان و آب\(D\ حدود 2\ برابر {10}^{-7}\) m2/s. تغییرات دما را می توان انتظار داشت این استقرار آنی افزایش دما نه تنها مدت زمان آزمایش را کوتاه می کند، بلکه امکان زمان بندی دقیق \(t=0\) را برای هر مطالعه دینامیکی اثرات دما فراهم می کند.
روش پیشنهادی ما برای هر بستر جذب کننده نور (به عنوان مثال، نمونه های تجاری با پوشش ITO) قابل اجرا است. با این حال، نانوذرات طلا قادر به ارائه جذب بالا در مادون قرمز و جذب کم در محدوده مرئی هستند، که ویژگی‌های اخیر برای مشاهده نوری موثر در محدوده مرئی، به ویژه هنگام استفاده از فلورسانس، مورد توجه است. علاوه بر این، طلا زیست سازگار، از نظر شیمیایی بی اثر است، چگالی نوری را می توان از 530 نانومتر تا نزدیک مادون قرمز تنظیم کرد، و آماده سازی نمونه ساده و مقرون به صرفه است.
میکروسکوپ جبهه موج توری عرضی (CGM) نه تنها به نقشه برداری دما در مقیاس میکرو اجازه می دهد، بلکه نظارت بر زیست توده را نیز امکان پذیر می کند، و در ترکیب با LA-HTM آن را بسیار مفید می کند (اگر لازم نباشد). در طول دهه گذشته، سایر تکنیک‌های میکروسکوپ دما، به‌ویژه در زمینه تصویربرداری زیستی، توسعه یافته‌اند و بیشتر آنها به استفاده از پروب‌های فلورسنت حساس به دما نیاز دارند. با این حال، این روش‌ها مورد انتقاد قرار گرفته‌اند و برخی گزارش‌ها تغییرات دمای غیرواقعی را در سلول‌ها اندازه‌گیری کرده‌اند، احتمالاً به دلیل این واقعیت است که فلورسانس به عوامل زیادی غیر از دما بستگی دارد. علاوه بر این، بیشتر پروب های فلورسنت در دماهای بالا ناپایدار هستند. بنابراین، QPM و به طور خاص CGM یک تکنیک میکروسکوپ دمای ایده آل برای مطالعه زندگی در دماهای بالا با استفاده از میکروسکوپ نوری است.
مطالعات S. shibatae که در دمای 80 درجه سانتیگراد به طور مطلوب زندگی می کنند، نشان می دهد که LA-HTM را می توان برای مطالعه هیپرترموفیل ها، نه فقط ترموفیل های ساده، به کار برد. در اصل، هیچ محدودیتی برای محدوده دماهایی که می توان با استفاده از LA-HTM به دست آورد، وجود ندارد، و حتی دماهای بالاتر از 100 درجه سانتیگراد را می توان در فشار اتمسفر بدون جوشش به دست آورد، همانطور که توسط گروه 38 ما در کاربردهای شیمی گرمابی در اتمسفر نشان داده شده است. فشار A. یک لیزر برای گرم کردن نانوذرات طلا 40 به همین ترتیب استفاده می شود. بنابراین، LA-HTM پتانسیل استفاده برای مشاهده هایپرترموفیل های بی سابقه با میکروسکوپ نوری استاندارد با وضوح بالا را در شرایط استاندارد (یعنی تحت تنش محیطی) دارد.
تمام آزمایش‌ها با استفاده از میکروسکوپ خانگی، از جمله روشنایی کوهلر (با LED، M625L3، Thorlabs، 700 میلی‌وات)، نگهدارنده نمونه با حرکت xy دستی، اهداف (Olympus، 60x، 0.7 NA، هوا، LUCPlanFLN60X یا 60x، NA1) انجام شد. ، UPLFLN60XOI)، دوربین CGM (گریت متقاطع QLSI، گام 39 میکرومتر، 0.87 میلی متر از سنسور دوربین Andor Zyla) برای ارائه تصویربرداری شدت و جبهه موج، و دوربین sCMOS (ORCA Flash 4.0 V3، حالت 16 بیت، از Hamamatsu) برای ضبط داده های نشان داده شده در شکل 5 (شنای باکتریایی). تقسیم‌کننده پرتو دو رنگی یک لبه BrightLine 749 نانومتری است (Semrock، FF749-SDi01). فیلتر جلوی دوربین یک فیلتر گذر کوتاه 694 (FF02-694/SP-25، Semrock) است. لیزر تیتانیوم یاقوت کبود (لیزر وردی G10، 532 نانومتر، 10 وات، حفره لیزر سونامی پمپ شده، Spectra-Physics در شکل 2-5، با لیزر Millenia، Spectraphysics 10 W، حفره لیزر پمپ شده میرا، منسجم2، جایگزین شده است. -5). 6 و 7) روی طول موج \({{{({\rm{\lambda }}}}}=800\) نانومتر تنظیم شده‌اند که مربوط به طیف تشدید پلاسمون نانوذرات طلا است. تعدیل‌کننده‌های نور فضایی (1920 × 1152 پیکسل) از Meadowlark Optics با استفاده از الگوریتم Gerchberg-Saxton محاسبه شد.
میکروسکوپ جبهه موج متقاطع (CGM) یک تکنیک میکروسکوپ نوری است که بر اساس ترکیب یک شبکه پراش دو بعدی (همچنین به عنوان گریتینگ متقاطع شناخته می‌شود) در فاصله یک میلی‌متری از سنسور دوربین معمولی است. رایج‌ترین نمونه از CGM که در این مطالعه استفاده کرده‌ایم تداخل سنج انتقال عرضی چهار طول موج (QLSI) نامیده می‌شود، که در آن توری متقاطع شامل یک الگوی شطرنجی شدت/فاز است که توسط Primot و همکارانش معرفی و ثبت شده است. در سال 200034. خطوط توری عمودی و افقی سایه های شبکه مانندی را روی حسگر ایجاد می کنند که اعوجاج آنها را می توان به صورت عددی در زمان واقعی پردازش کرد تا اعوجاج جبهه موج نوری (یا مشخصات فاز معادل) نور فرودی را بدست آورد. هنگامی که دوربین CGM روی میکروسکوپ استفاده می‌شود، می‌تواند تفاوت مسیر نوری یک جسم تصویر شده را که به عنوان عمق نوری (OT) نیز شناخته می‌شود، با حساسیت حدود نانومتر نمایش دهد. در هر اندازه گیری CGM، برای از بین بردن هر گونه نقص در اجزای نوری یا پرتوها، باید یک تصویر OT مرجع اولیه گرفته شود و از تصاویر بعدی کم شود.
میکروسکوپ دما با استفاده از دوربین CGM همانطور که در مرجع توضیح داده شد انجام شد. 32. به طور خلاصه، حرارت دادن یک مایع ضریب شکست آن را تغییر می دهد و یک اثر عدسی حرارتی ایجاد می کند که پرتو فرودی را مخدوش می کند. این اعوجاج جبهه موج توسط CGM اندازه‌گیری می‌شود و با استفاده از یک الگوریتم دکانولوشن پردازش می‌شود تا توزیع دما سه بعدی در محیط مایع به دست آید. اگر نانوذرات طلا به طور مساوی در سراسر نمونه توزیع شوند، نقشه برداری دما را می توان در مناطق عاری از باکتری انجام داد تا تصاویر بهتری تولید شود، کاری که ما گاهی انجام می دهیم. تصویر CGM مرجع بدون گرم کردن (با لیزر خاموش) گرفته شد و متعاقباً در همان مکان در تصویر با لیزر روشن گرفته شد.
اندازه گیری جرم خشک با استفاده از همان دوربین CGM مورد استفاده برای تصویربرداری دما انجام می شود. تصاویر مرجع CGM با حرکت سریع نمونه در x و y در طول قرار گرفتن در معرض به عنوان وسیله ای برای میانگین هر گونه ناهمگنی در OT به دلیل وجود باکتری به دست آمد. از تصاویر OT از باکتری ها، زیست توده آنها با استفاده از مجموعه ای از تصاویر بر روی مناطق انتخاب شده با استفاده از الگوریتم تقسیم بندی خانگی Matlab به دست آمد (به بخش فرعی "کد عددی" مراجعه کنید)، به دنبال روش شرح داده شده در رفر. 48. به طور خلاصه، از رابطه \(m={\alpha}^{-1}\iint {{\mbox{OT}}}\left(x,y\right){{\mbox{d}} استفاده می‌کنیم. } x{{\mbox{d}}}y\)، جایی که \({{\mbox{OT}}}\left(x,y\right)\) تصویر عمق نوری است، \(m\) وزن خشک و \({{{{\rm{\alpha }}}}}}\) یک ثابت است. ما \({{{{\rm{\alpha))))))=0.18\) μm3/pg را انتخاب کردیم که یک ثابت معمولی برای سلول‌های زنده است.
یک لغزش پوششی به قطر 25 میلی متر و ضخامت 150 میکرومتر که با نانوذرات طلا پوشانده شده بود، در یک محفظه AttofluorTM (Thermofisher) با نانوذرات طلا رو به بالا قرار داده شد. Geobacillus stearothermophilus یک شبه در محیط LB (200 دور در دقیقه، 60 درجه سانتیگراد) قبل از هر روز آزمایش کشت داده شد. قطره 5 میکرولیتر از یک سوسپانسیون G. stearothermophilus با چگالی نوری (OD) 0.3 تا 0.5 بر روی یک ورقه پوششی با نانوذرات طلا قرار داده شد. سپس یک لغزش پوششی گرد به قطر 18 میلی‌متر با سوراخی به قطر 5 میلی‌متر در مرکز روی قطره ریخته شد و 5 میکرولیتر از سوسپانسیون باکتریایی با همان چگالی نوری به طور مکرر به مرکز سوراخ اعمال شد. چاه های روی لپه های پوششی مطابق با روشی که در رفرنس توضیح داده شده تهیه شده اند. 45 (برای اطلاعات بیشتر به اطلاعات تکمیلی مراجعه کنید). سپس برای جلوگیری از خشک شدن لایه مایع، 1 میلی لیتر از محیط LB را به روکش اضافه کنید. آخرین پوشش روی درب بسته محفظه Attofluor™ قرار می گیرد تا از تبخیر محیط در طول انکوباسیون جلوگیری شود. برای آزمایش های جوانه زنی از هاگ ها استفاده کردیم که پس از آزمایش های معمولی، گاهی قسمت بالایی پوشش را می پوشاند. روش مشابهی برای بدست آوردن Sulfolobus shibatae استفاده شد. سه روز (200 دور در دقیقه، 75 درجه سانتی گراد) کشت اولیه تیوباسیلوس سراتا در محیط کشت 182 (DSMZ) انجام شد.
نمونه‌هایی از نانوذرات طلا با لیتوگرافی کوپلیمر بلوک میسلی تهیه شد. این فرآیند به تفصیل در فصل توضیح داده شده است. 60. به طور خلاصه، میسل های محصور کننده یون های طلا با مخلوط کردن کوپلیمر با HAuCl4 در تولوئن سنتز شدند. ورقه های پوششی تمیز شده سپس در محلول غوطه ور شدند و با تابش اشعه ماوراء بنفش در حضور یک عامل کاهنده تحت درمان قرار گرفتند تا دانه های طلا بدست آید. در نهایت، دانه‌های طلا با تماس یک لایه پوششی با محلول آبی KAuCl4 و اتانول آمین به مدت 16 دقیقه رشد کردند که منجر به آرایش شبه دوره‌ای و بسیار یکنواخت نانوذرات طلای غیرکروی در مادون قرمز نزدیک شد.
برای تبدیل تداخل‌گرام‌ها به تصاویر OT، از یک الگوریتم خانگی استفاده کردیم که در لینک توضیح داده شده است. 33 و به صورت بسته Matlab در مخزن عمومی زیر موجود است: https://github.com/baffou/CGMprocess. این بسته می‌تواند شدت و تصاویر OT را بر اساس تداخل‌نگارهای ثبت‌شده (از جمله تصاویر مرجع) و فاصله‌های آرایه دوربین محاسبه کند.
برای محاسبه الگوی فاز اعمال شده به SLM برای به دست آوردن یک پروفایل دمایی معین، از یک الگوریتم خانگی که قبلاً توسعه داده شده بود استفاده کردیم که در مخزن عمومی زیر موجود است: https://github.com/baffou/SLM_temperatureShaping. ورودی میدان دمای مورد نظر است که می تواند به صورت دیجیتال یا از طریق یک تصویر تک رنگ bmp تنظیم شود.
برای تقسیم بندی سلول ها و اندازه گیری وزن خشک آنها، از الگوریتم Matlab خود که در مخزن عمومی زیر منتشر شده است استفاده کردیم: https://github.com/baffou/CGM_magicWandSegmentation. در هر تصویر، کاربر باید روی باکتری یا mCFU مورد نظر کلیک کند، حساسیت گره را تنظیم کند و انتخاب را تأیید کند.
برای کسب اطلاعات بیشتر در مورد طراحی مطالعه، چکیده گزارش تحقیقات طبیعت را که به این مقاله پیوند داده شده است، ببینید.
داده های حمایت کننده از نتایج این مطالعه در صورت درخواست معقول از نویسندگان مربوطه در دسترس است.
کد منبع مورد استفاده در این مطالعه در بخش روش‌ها به تفصیل آمده است و نسخه‌های اشکال‌زدایی را می‌توانید از https://github.com/baffou/ در مخازن زیر دانلود کنید: SLM_temperatureShaping، CGMprocess، و CGM_magicWandSegmentation.
Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Insight to thermophiles و کاربردهای طیف وسیع آنها. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Insight to thermophiles و کاربردهای طیف وسیع آنها.Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. and Sharma, AK بررسی اجمالی ترموفیل ها و کاربرد گسترده آنها. مهتا، آر.، سینگال، پی، سینگ، اچ، دامل، دی و شارما، AK 深入了解嗜热菌及其广谱应用。 مهتا، آر.، سینگال، پی، سینگ، اچ، دامل، دی و شارما، AK.Mehta R., Singhal P., Singh H., Damle D. and Sharma AK درک عمیق ترموفیل ها و طیف وسیعی از کاربردها.3 بیوتکنولوژی 6، 81 (2016).