پروتئومیکس جامع بیومارکرهای مایع مغزی نخاعی مبتنی بر مغز را در بیماری آلزایمر بدون علامت و علامت دار نشان می دهد.

بیماری آلزایمر (AD) فاقد بیومارکرهای پروتئینی است که منعکس کننده پاتوفیزیولوژی زیربنایی متعدد آن است و مانع پیشرفت تشخیص و درمان می شود. در اینجا، ما از پروتئومیک جامع برای شناسایی بیومارکرهای مایع مغزی نخاعی (CSF) استفاده می‌کنیم که طیف وسیعی از پاتوفیزیولوژی AD را نشان می‌دهند. طیف سنجی جرمی چندگانه تقریباً 3500 و تقریباً 12000 پروتئین را به ترتیب در AD CSF و مغز شناسایی کرد. تجزیه و تحلیل شبکه پروتئوم مغز 44 ماژول تنوع زیستی را حل کرد که 15 مورد از آنها با پروتئوم مایع مغزی نخاعی همپوشانی داشتند. نشانگرهای CSF AD در این ماژول های همپوشانی به پنج گروه پروتئینی تا می شوند که نشان دهنده فرآیندهای پاتوفیزیولوژیکی مختلف است. سیناپس ها و متابولیت ها در مغز AD کاهش می یابد، اما CSF افزایش می یابد، در حالی که میلیناسیون غنی از گلیال و گروه های ایمنی در مغز و CSF افزایش می یابد. قوام و ویژگی بیماری تغییرات پانل در بیش از 500 نمونه اضافی CSF تایید شد. این گروه ها همچنین زیر گروه های بیولوژیکی را در AD بدون علامت شناسایی کردند. به طور کلی، این نتایج گامی امیدوارکننده به سمت ابزارهای نشانگر زیستی مبتنی بر وب برای کاربردهای بالینی در AD است.
بیماری آلزایمر (AD) شایع ترین علت زوال عقل عصبی در سراسر جهان است و با طیف گسترده ای از اختلالات سیستم بیولوژیکی، از جمله انتقال سیناپسی، ایمنی با واسطه گلیال، و متابولیسم میتوکندری مشخص می شود (1-3). با این حال، بیومارکرهای پروتئینی تثبیت شده آن هنوز بر روی تشخیص پروتئین آمیلوئید و تاو تمرکز دارند و بنابراین نمی توانند این پاتوفیزیولوژی متنوع را منعکس کنند. این بیومارکرهای پروتئینی "هسته" که با اطمینان بیشتری در مایع مغزی نخاعی (CSF) اندازه‌گیری می‌شوند عبارتند از (i) پپتید بتا آمیلوئید 1-42 (Aβ1-42)، که منعکس‌کننده تشکیل پلاک‌های آمیلوئید قشر مغز است. (ii) تاو کل، نشانه دژنراسیون آکسون. (iii) phospho-tau (p-tau)، نماینده هیپرفسفوریلاسیون تاو پاتولوژیک (4-7). اگرچه این بیومارکرهای مایع مغزی نخاعی تشخیص بیماری‌های پروتئینی AD "مشخص شده" را بسیار تسهیل کرده‌اند (4-7)، آنها تنها بخش کوچکی از زیست‌شناسی پیچیده پشت این بیماری را نشان می‌دهند.
فقدان تنوع پاتوفیزیولوژیک بیومارکرهای AD منجر به چالش‌های زیادی شده است، از جمله (1) ناتوانی در شناسایی و تعیین کمیت ناهمگنی بیولوژیکی بیماران AD، (ب) اندازه‌گیری ناکافی شدت و پیشرفت بیماری، به ویژه در مرحله پیش بالینی، و iii) توسعه داروهای درمانی که نتوانستند تمام جنبه های زوال عصبی را به طور کامل حل کنند. تکیه ما به آسیب شناسی شاخص برای توصیف AD از بیماری های مرتبط تنها این مشکلات را تشدید می کند. شواهد روزافزون نشان می دهد که اکثر سالمندان مبتلا به زوال عقل بیش از یک ویژگی آسیب شناختی زوال شناختی دارند (8). بیش از 90٪ یا بیشتر از افراد مبتلا به آسیب شناسی AD همچنین دارای بیماری عروقی، گنجاندن TDP-43 یا سایر بیماری های دژنراتیو هستند (9). این نسبت های بالای همپوشانی پاتولوژیک، چارچوب تشخیصی کنونی ما را برای زوال عقل مختل کرده است و به تعریف پاتوفیزیولوژیک جامع تری از این بیماری نیاز است.
با توجه به نیاز فوری به انواع نشانگرهای زیستی AD، این زمینه به طور فزاینده ای روش "omics" را بر اساس سیستم کلی برای کشف نشانگرهای زیستی اتخاذ می کند. اتحاد شتابدهی مشارکت دارویی (AMP)-AD در سال 2014 راه اندازی شد و در خط مقدم این برنامه قرار دارد. این تلاش چند رشته ای توسط مؤسسه ملی بهداشت، دانشگاه و صنعت با هدف استفاده از استراتژی های مبتنی بر سیستم برای تعریف بهتر پاتوفیزیولوژی AD و توسعه تجزیه و تحلیل تشخیصی تنوع زیستی و استراتژی های درمانی است (10). به عنوان بخشی از این پروژه، پروتئومیکس شبکه به ابزاری امیدوارکننده برای پیشرفت نشانگرهای زیستی مبتنی بر سیستم در AD تبدیل شده است. این رویکرد مبتنی بر داده های بی طرفانه، مجموعه داده های پیچیده پروتئومیکس را در گروه ها یا "ماژول هایی" از پروتئین های هم بیان شده که با انواع سلول ها، اندامک ها و عملکردهای بیولوژیکی خاص مرتبط هستند، سازماندهی می کند (11-13). تقریباً 12 مطالعه پروتئومیکس شبکه غنی از اطلاعات بر روی مغز AD انجام شده است (13-23). به طور کلی، این تجزیه و تحلیل ها نشان می دهد که پروتئوم شبکه مغز AD یک سازمان مدولار بسیار محافظت شده را در گروه های مستقل و مناطق متعدد قشری حفظ می کند. علاوه بر این، برخی از این ماژول‌ها تغییرات قابل تکرار در فراوانی مرتبط با AD را در مجموعه داده‌ها نشان می‌دهند که منعکس کننده پاتوفیزیولوژی بیماری‌های متعدد است. در مجموع، این یافته ها نقطه لنگر امیدوارکننده ای را برای کشف پروتئوم شبکه مغز به عنوان یک نشانگر زیستی مبتنی بر سیستم در AD نشان می دهد.
به منظور تبدیل پروتئوم شبکه مغز AD به نشانگرهای زیستی مبتنی بر سیستم مفید بالینی، ما شبکه مشتق شده از مغز را با تجزیه و تحلیل پروتئومی AD CSF ترکیب کردیم. این رویکرد یکپارچه منجر به شناسایی پنج مجموعه امیدوارکننده از بیومارکرهای CSF شد که با طیف وسیعی از پاتوفیزیولوژی مبتنی بر مغز، از جمله سیناپس‌ها، رگ‌های خونی، میلین، التهاب و اختلال عملکرد مسیرهای متابولیک مرتبط هستند. ما با موفقیت این پانل‌های نشانگر زیستی را از طریق آنالیزهای تکراری چندگانه، از جمله بیش از 500 نمونه CSF از بیماری‌های مختلف عصبی تأیید کردیم. این تحلیل‌های اعتبارسنجی شامل بررسی اهداف گروهی در CSF بیماران مبتلا به AD بدون علامت (AsymAD) یا نشان دادن شواهدی از تجمع غیرطبیعی آمیلوئید در یک محیط شناختی طبیعی است. این تحلیل‌ها ناهمگونی بیولوژیکی قابل‌توجهی را در جمعیت AsymAD برجسته می‌کنند و نشانگرهای پانل را شناسایی می‌کنند که ممکن است قادر به دسته‌بندی افراد در مراحل اولیه بیماری باشند. به طور کلی، این نتایج نشان‌دهنده یک گام کلیدی در توسعه ابزارهای نشانگر زیستی پروتئین بر اساس سیستم‌های متعدد است که می‌تواند بسیاری از چالش‌های بالینی را با موفقیت حل کند.
هدف اصلی این مطالعه شناسایی بیومارکرهای جدید مایع مغزی نخاعی است که منعکس کننده پاتوفیزیولوژی های مختلف مبتنی بر مغز است که منجر به AD می شود. شکل S1 روش تحقیق ما را تشریح می کند، که شامل (1) یک تجزیه و تحلیل جامع بر اساس یافته های اولیه AD CSF و پروتئوم مغز شبکه برای شناسایی نشانگرهای زیستی بیماری CSF مرتبط با مغز، و (ii) تکرار بعدی این نشانگرهای زیستی در چندین مغزی نخاعی مستقل هستند. گروه های سیال تحقیقات کشف محور با تجزیه و تحلیل بیان افتراقی CSF در 20 فرد از نظر شناختی سالم و 20 بیمار AD در مرکز تحقیقات بیماری آلزایمر Emory Goizueta (ADRC) آغاز شد. تشخیص AD به عنوان یک اختلال شناختی قابل توجه در حضور کم Aβ1-42 و سطوح بالا تاو و p-tau کل در مایع مغزی نخاعی [میانگین ارزیابی شناختی مونترال (MoCA)، 7.0 ± 13.8] [ELISA (ELISA] تعریف می شود. )]] (جدول S1A). شاهد (میانگین MoCA، 2.2 ± 26.7) سطوح طبیعی بیومارکرهای CSF داشتند.
CSF انسان با محدوده دینامیکی فراوانی پروتئین مشخص می شود که در آن آلبومین و سایر پروتئین های بسیار فراوان می توانند از تشخیص پروتئین های مورد نظر جلوگیری کنند (24). برای افزایش عمق کشف پروتئین، ما 14 پروتئین بسیار فراوان را از هر نمونه CSF قبل از تجزیه و تحلیل طیف سنجی جرمی (MS) حذف کردیم (24). در مجموع 39805 پپتید توسط MS شناسایی شد که به 3691 پروتئوم در 40 نمونه نگاشت شدند. تعیین کمیت پروتئین با برچسب گذاری چندگانه توده ای پشت سر هم (TMT) انجام می شود (18، 25). به منظور حل و فصل داده‌های از دست رفته، ما فقط پروتئین‌هایی را وارد کردیم که در حداقل 50 درصد نمونه‌ها در تجزیه و تحلیل‌های بعدی کمی‌سازی شدند، بنابراین در نهایت 2875 پروتئوم را تعیین کردیم. با توجه به تفاوت معنی دار در سطوح فراوانی پروتئین کل، یک نمونه شاهد از نظر آماری به عنوان یک نمونه پرت در نظر گرفته شد (13) و در تجزیه و تحلیل بعدی لحاظ نشد. مقادیر فراوانی 39 نمونه باقی مانده بر اساس سن، جنس و کوواریانس دسته ای (13-15، 17، 18، 20، 26) تنظیم شد.
با استفاده از تجزیه و تحلیل آماری t-test برای ارزیابی بیان دیفرانسیل در مجموعه داده‌های رگرسیون، این تجزیه و تحلیل پروتئین‌هایی را شناسایی کرد که سطوح فراوانی آن‌ها به طور معنی‌داری (05/0P<) بین موارد شاهد و AD تغییر کرد (جدول S2A). همانطور که در شکل 1A نشان داده شده است، فراوانی در مجموع 225 پروتئین در AD به طور قابل توجهی کاهش یافته است و فراوانی 303 پروتئین به طور قابل توجهی افزایش یافته است. این پروتئین های متفاوت بیان شده شامل چندین نشانگر AD مایع مغزی نخاعی شناسایی شده قبلی، مانند پروتئین tau مرتبط با میکروتوبول (MAPT؛ P = 3.52 × 10-8)، نوروفیلامنت (NEFL؛ P = 6.56 × 10-3)، پروتئین مرتبط با رشد 43 است. (GAP43؛ P = 1.46 × 10-5)، پروتئین اتصال دهنده اسید چرب 3 (FABP3؛ P = 2.00 × 10-5)، کیتیناز 3 مانند 1 (CHI3L1؛ P = 4.44 × 10-6)، گرانولین عصبی (NRGN; P = 3.43 × 10-4) و فاکتور رشد عصب VGF (VGF؛ P = 4.83 × 10-3) (4-6). با این حال، ما اهداف بسیار مهم دیگری مانند بازدارنده تفکیک تولید ناخالص داخلی 1 (GDI1؛ P = 1.54 × 10-10) و پیوند کلسیم مدولار مربوط به SPARC 1 (SMOC1؛ P = 6.93 × 10-9) را شناسایی کردیم. تجزیه و تحلیل ژن هستی شناسی (GO) از 225 پروتئین کاهش قابل توجهی، ارتباط نزدیک با فرآیندهای مایع بدن مانند متابولیسم استروئید، انعقاد خون، و فعالیت هورمون را نشان داد (شکل 1B و جدول S2B). در مقابل، افزایش قابل توجه پروتئین 303 ارتباط نزدیکی با ساختار سلولی و متابولیسم انرژی دارد.
(الف) نمودار آتشفشان تغییر برابری log2 (محور x) را نسبت به مقدار P آماری -log10 (محور y) نشان می‌دهد که توسط آزمون t بدست آمده است، که برای تشخیص بیان دیفرانسیل بین کنترل (CT) و استفاده می‌شود. موارد AD پروتئوم CSF از همه پروتئین ها. پروتئین هایی با سطوح کاهش یافته قابل توجهی (P<0.05) در AD به رنگ آبی نشان داده شده اند، در حالی که پروتئین هایی با سطوح قابل توجه افزایش یافته در بیماری با رنگ قرمز نشان داده شده اند. پروتئین انتخاب شده برچسب گذاری شده است. (ب) اصطلاحات برتر GO مربوط به پروتئین به طور قابل توجهی کاهش می یابد (آبی) و افزایش (قرمز) در AD. سه عبارت GO را با بالاترین امتیاز z در زمینه‌های فرآیندهای بیولوژیکی، عملکردهای مولکولی و اجزای سلولی نشان می‌دهد. (C) MS سطح MAPT را در نمونه CSF (سمت چپ) و همبستگی آن با سطح tau ELISA نمونه (راست) اندازه‌گیری کرد. ضریب همبستگی پیرسون با مقدار P مربوطه نمایش داده می شود. به دلیل عدم وجود داده های ELISA برای یک مورد AD، این ارقام شامل مقادیر 38 مورد از 39 مورد تجزیه و تحلیل شده است. (D) تجزیه و تحلیل خوشه ای نظارت شده (P <0.0001، بنجامینی-هوچبرگ (BH) P <0.01 تنظیم شده) بر روی نمونه های شاهد و AD CSF با استفاده از 65 پروتئین به طور قابل توجهی تغییر یافته در مجموعه داده ها. استاندارد کردن، عادی کردن.
سطح پروتئومی MAPT ارتباط نزدیکی با سطح تاو ELISA اندازه گیری شده مستقل دارد (r = 0.78، P = 7.8 × 10-9؛ شکل 1C)، که از اعتبار اندازه گیری MS ما حمایت می کند. پس از هضم تریپسین در سطح پروتئین پیش ساز آمیلوئید (APP)، پپتیدهای خاص ایزوفرم که در انتهای C Aβ1-40 و Aβ1-42 نقشه برداری شده اند، نمی توانند به طور موثر یونیزه شوند (27، 28). بنابراین، پپتیدهای APP که ما شناسایی کردیم هیچ ارتباطی با سطوح ELISA Aβ1-42 ندارند. به منظور ارزیابی بیان افتراقی هر مورد، ما از پروتئین‌های بیان شده متفاوت با P <0.0001 [نرخ کشف نادرست (FDR) تصحیح شده P <0.01] برای انجام تجزیه و تحلیل خوشه‌ای نظارت شده از نمونه‌ها استفاده کردیم (جدول S2A). همانطور که در شکل 1D نشان داده شده است، این 65 پروتئین بسیار مهم می توانند به درستی نمونه ها را بر اساس وضعیت بیماری خوشه بندی کنند، به جز یک مورد AD با ویژگی های مشابه کنترل. از این 65 پروتئین، 63 پروتئین در AD افزایش یافت، در حالی که تنها دو (CD74 و ISLR) کاهش یافتند. در مجموع، این تجزیه و تحلیل مایع مغزی نخاعی صدها پروتئین را در AD شناسایی کرده است که ممکن است به عنوان نشانگرهای زیستی بیماری عمل کنند.
سپس یک تحلیل شبکه مستقل از پروتئوم مغز AD انجام دادیم. گروه مغزی این کشف شامل قشر جلوی پیشانی پشتی جانبی (DLPFC) از شاهد (10 نفر)، بیماری پارکینسون (PD؛ 10=n)، AD/PD مختلط (10=n) و AD (10=n) مورد بود. ) نمونه. Emery Goizueta ADRC. جمعیت شناسی این 40 مورد قبلاً شرح داده شده است (25) و در جدول S1B خلاصه شده است. ما از TMT-MS برای تجزیه و تحلیل این 40 بافت مغز و گروه تکراری 27 مورد استفاده کردیم. در مجموع، این دو مجموعه داده مغزی 227121 پپتید منحصر به فرد تولید کردند که به 12943 پروتئوم نگاشت شدند (25). فقط آن دسته از پروتئین هایی که در حداقل 50 درصد موارد اندازه گیری شده بودند در تحقیقات بعدی گنجانده شدند. مجموعه داده های کشف نهایی شامل 8817 پروتئین کمیت شده است. سطح فراوانی پروتئین را بر اساس سن، جنسیت و فاصله پس از مرگ (PMI) تنظیم کنید. تجزیه و تحلیل بیان دیفرانسیل مجموعه داده‌ها پس از رگرسیون نشان داد که سطح پروتئین بیش از 2000 به طور قابل‌توجهی تغییر کرد [05/0 > P، آنالیز واریانس (ANOVA)] در دو یا چند گروه بیماری. سپس، ما یک تجزیه و تحلیل خوشه‌ای نظارت شده بر اساس پروتئین‌های بیان شده متفاوت و P <0.0001 در مقایسه‌های AD/کنترل و/یا AD/PD انجام دادیم (شکل S2، A و B، جدول S2C). این 165 پروتئین بسیار تغییر یافته به وضوح مواردی را با آسیب شناسی AD از نمونه های کنترل و PD نشان می دهند و تغییرات قوی خاص AD را در کل پروتئوم تایید می کنند.
سپس از الگوریتمی به نام تحلیل شبکه هم‌اظهار ژن وزنی (WGCNA) برای انجام تجزیه و تحلیل شبکه بر روی پروتئوم کشف‌شده مغز استفاده کردیم که مجموعه داده‌ها را در ماژول‌های پروتئینی با الگوهای بیان مشابه سازمان‌دهی می‌کند (11-13). تجزیه و تحلیل 44 ماژول (M) پروتئینی را شناسایی کرد که با هم بیان می‌شوند، مرتب‌سازی و شماره‌گذاری شده‌اند از بزرگترین (M1، n = 1821 پروتئین) تا کوچک‌ترین (M44، n = 34 پروتئین) (شکل 2A و جدول S2D)). همانطور که در بالا ذکر شد (13) نمایه بیان نماینده یا پروتئین مشخصه هر ماژول را محاسبه کنید و آن را با وضعیت بیماری و آسیب شناسی AD مرتبط کنید، یعنی اتحاد ثبت بیماری آلزایمر (CERAD) و امتیاز براک (شکل 2B) را ایجاد کنید. به طور کلی، 17 ماژول به طور قابل توجهی با آسیب شناسی عصبی AD مرتبط بود (P <0.05). بسیاری از این ماژول های مرتبط با بیماری نیز غنی از نشانگرهای نوع سلولی هستند (شکل 2B). همانطور که در بالا ذکر شد (13)، غنی سازی نوع سلول با تجزیه و تحلیل همپوشانی ماژول و لیست مرجع ژن های نوع خاص سلول تعیین می شود. این ژن ها از داده های منتشر شده در نورون های جدا شده موش، سلول های اندوتلیال و گلیال مشتق شده اند. آزمایش توالی یابی RNA (RNA-seq) (29).
(الف) WGCNA پروتئوم مغز را کشف کنید. (B) تجزیه و تحلیل همبستگی میان وزنی (BiCor) پروتئین امضای مدولار (اولین جزء اصلی بیان پروتئین مدولار) با ویژگی‌های آسیب‌شناسی عصبی AD (بالا)، از جمله نمرات CERAD (پلاک Aβ) و براک (تاو درهم). شدت همبستگی‌های مثبت (قرمز) و منفی (آبی) با یک نقشه حرارتی دو رنگ نشان داده شده است و ستاره‌ها معنی‌دار آماری را نشان می‌دهند (P<0.05). از آزمون دقیق Hypergeometric Fisher (FET) (پایین) برای ارزیابی ارتباط نوع سلولی هر ماژول پروتئین استفاده کنید. شدت سایه قرمز نشان‌دهنده درجه غنی‌سازی نوع سلولی و ستاره نشان‌دهنده معنی‌داری آماری است (۰۵/۰P<). برای تصحیح مقدار P حاصل از FET از روش BH استفاده کنید. (C) تجزیه و تحلیل GO از پروتئین های مدولار. نزدیک ترین فرآیندهای بیولوژیکی مرتبط برای هر ماژول یا گروه ماژول مرتبط نشان داده شده است. الیگو، الیگودندروسیت.
مجموعه ای از پنج ماژول غنی از آستروسیت و میکروگلیا (M30، M29، M18، M24، و M5) ارتباط نزدیک مثبتی با آسیب شناسی عصبی AD نشان داد (شکل 2B). تجزیه و تحلیل هستی شناسی این ماژول های گلیال را با رشد، تکثیر و ایمنی سلولی مرتبط می کند (شکل 2C و جدول S2E). دو ماژول گلیال اضافی، M8 و M22 نیز به شدت در بیماری تنظیم می شوند. M8 ارتباط زیادی با مسیر گیرنده Toll مانند دارد، یک آبشار سیگنالینگ که نقش کلیدی در پاسخ ایمنی ذاتی دارد (30). در عین حال، M22 ارتباط نزدیکی با اصلاحات پس از ترجمه دارد. M2، که غنی از الیگودندروسیت است، یک همبستگی مثبت قوی با آسیب شناسی AD و یک ارتباط هستی شناختی با سنتز نوکلئوزید و تکثیر DNA نشان می دهد، که نشان دهنده افزایش تکثیر سلولی در بیماری ها است. به طور کلی، این یافته‌ها از ارتفاع ماژول‌های گلیال که قبلاً در پروتئوم شبکه AD مشاهده کرده‌ایم، پشتیبانی می‌کنند (13، 17). در حال حاضر مشخص شده است که بسیاری از ماژول‌های گلیال مرتبط با AD در شبکه سطوح بیان پایین‌تری را در موارد کنترل و PD نشان می‌دهند، که ویژگی بیماری آن‌ها را برجسته می‌کند که در AD افزایش یافته است (شکل S2C).
فقط چهار ماژول در پروتئوم شبکه ما (M1، M3، M10، و M32) به شدت با آسیب شناسی AD همبستگی منفی دارند (P<0.05) (شکل 2، B و C). هر دو M1 و M3 سرشار از نشانگرهای عصبی هستند. M1 ارتباط زیادی با سیگنال های سیناپسی دارد، در حالی که M3 ارتباط نزدیکی با عملکرد میتوکندری دارد. شواهدی مبنی بر غنی سازی نوع سلولی برای M10 و M32 وجود ندارد. M32 منعکس کننده ارتباط بین M3 و متابولیسم سلولی است، در حالی که M10 ارتباط زیادی با رشد سلولی و عملکرد میکروتوبول دارد. در مقایسه با AD، هر چهار ماژول در کنترل و PD افزایش یافته و تغییرات AD خاص بیماری را به آنها می دهد (شکل S2C). به طور کلی، این نتایج از کاهش فراوانی ماژول های غنی از نورون پشتیبانی می کند که قبلاً در AD مشاهده کرده بودیم (13، 17). به طور خلاصه، تجزیه و تحلیل شبکه ای از پروتئوم مغزی که ما کشف کردیم، ماژول های تغییر یافته مخصوص AD را مطابق با یافته های قبلی ما تولید کرد.
AD با مرحله اولیه بدون علامت (AsymAD) مشخص می شود، که در آن افراد تجمع آمیلوئید را بدون کاهش شناختی بالینی نشان می دهند (5، 31). این مرحله بدون علامت یک پنجره حیاتی برای تشخیص زودهنگام و مداخله است. ما قبلاً حفظ مدولار قوی پروتئوم شبکه مغز AsymAD و AD را در مجموعه داده‌های مستقل نشان داده‌ایم (13، 17). به منظور اطمینان از اینکه شبکه مغزی که در حال حاضر کشف کردیم با این یافته های قبلی سازگار است، ما حفظ 44 ماژول را در مجموعه داده های تکراری از 27 سازمان DLPFC تجزیه و تحلیل کردیم. این سازمان ها شامل موارد کنترل (n = 10)، AsymAD (n = 8) و AD (n = 9) می باشد. نمونه های کنترل و AD در تجزیه و تحلیل گروه مغزی اکتشافی ما (جدول S1B) گنجانده شدند، در حالی که موارد AsymAD فقط در گروه تکرار منحصر به فرد بودند. این موارد AsymAD نیز از بانک مغز Emory Goizueta ADRC تهیه شده است. اگرچه شناخت در زمان مرگ طبیعی بود، سطوح آمیلوئید به طور غیر طبیعی بالا بود (میانگین CERAD، 0.5 ± 2.8) (جدول S1B).
تجزیه و تحلیل TMT-MS این 27 بافت مغز منجر به تعیین کمیت 11244 پروتئوم شد. این شمارش نهایی فقط شامل پروتئین هایی است که در حداقل 50 درصد نمونه ها کمیت شده اند. این مجموعه داده تکراری شامل 8638 (98.0٪) از 8817 پروتئین شناسایی شده در تجزیه و تحلیل مغز اکتشاف ما است، و تقریباً 3000 پروتئین به طور قابل توجهی بین گروه های کنترل و AD تغییر کرده است (05/0 P<، پس از آزمون تی زوجی توکی برای تجزیه و تحلیل واریانس) ( جدول S2F). در میان این پروتئین‌هایی که به طور متفاوت بیان می‌شوند، 910 نیز تغییرات سطح معنی‌داری را بین موارد کنترل پروتئوم AD و مغز نشان دادند (05/0P<، پس از آزمون تی زوجی ANOVA Tukey). شایان ذکر است که این نشانگرهای 910 در جهت تغییر بین پروتئوم ها (r = 0.94، P <1.0 × 10-200) بسیار سازگار هستند (شکل S3A). در میان پروتئین‌های افزایش‌یافته، پروتئین‌هایی که بیشترین تغییرات را بین مجموعه داده‌ها دارند، عمدتاً اعضای ماژول‌های M5 و M18 غنی از گلیال هستند (MDK، COL25A1، MAPT، NTN1، SMOC1 و GFAP). در میان پروتئین‌های کاهش‌یافته، آنهایی که بیشترین تغییرات را داشتند تقریباً منحصراً اعضای ماژول M1 (NPTX2، VGF و RPH3A) مرتبط با سیناپس بودند. ما بیشتر تغییرات مربوط به AD را در midkine (MDK)، CD44، پروتئین 1 (SFRP1) و VGF ترشح شده مرتبط با وسترن بلات (شکل S3B) تأیید کردیم. تجزیه و تحلیل حفظ ماژول نشان داد که حدود 80 درصد از ماژول‌های پروتئینی (34/44) در پروتئوم مغز به طور قابل‌توجهی در مجموعه داده‌های تکرار حفظ شدند (امتیاز z> 1.96، FDR تصحیح شده P <0.05) (شکل S3C). 14 مورد از این ماژول ها به طور ویژه بین دو پروتئوم رزرو شده بودند (نمره z> 10، FDR تصحیح شده P <1.0 × 10-23). به طور کلی، کشف و تکرار درجه بالایی از سازگاری در بیان دیفرانسیل و ترکیب مدولار بین پروتئوم مغز، تکرارپذیری تغییرات در پروتئین‌های قشر پیشانی AD را برجسته می‌کند. علاوه بر این، همچنین تایید کرد که AsymAD و بیماری های پیشرفته تر ساختار شبکه مغزی بسیار مشابهی دارند.
تجزیه و تحلیل دقیق‌تر بیان دیفرانسیل در مجموعه داده‌های تکثیر مغز، درجه قابل توجهی از تغییرات پروتئین AsymAD را برجسته می‌کند، از جمله در مجموع 151 پروتئین تغییر قابل توجهی بین AsymAD و شاهد (P <0.05) (شکل S3D). مطابق با بار آمیلوئید، APP در مغز AsymAD و AD به طور قابل توجهی افزایش یافت. MAPT فقط در AD به طور قابل توجهی تغییر می کند، که با افزایش سطوح درهم تنیدگی و همبستگی شناخته شده آن با زوال شناختی سازگار است (5، 7). ماژول‌های غنی از گلیال (M5 و M18) به شدت در افزایش پروتئین در AsymAD منعکس می‌شوند، در حالی که ماژول M1 مرتبط با نورون نماینده‌ترین پروتئین کاهش‌یافته در AsymAD است. بسیاری از این نشانگرهای AsymAD تغییرات بیشتری را در بیماری های علامت دار نشان می دهند. از جمله این نشانگرها SMOC1، یک پروتئین گلیال متعلق به M18 است که با تومورهای مغزی و رشد چشم ها و اندام ها مرتبط است (32). MDK یک فاکتور رشد اتصال دهنده به هپارین است که با رشد سلولی و رگ زایی مرتبط است (33)، یکی دیگر از اعضای M18. در مقایسه با گروه کنترل، AsymAD به طور قابل توجهی افزایش یافت و به دنبال آن افزایش بیشتری در AD مشاهده شد. در مقابل، پروتئین سیناپسی نوروپنتراکسین 2 (NPTX2) به طور قابل توجهی در مغز AsymAD کاهش یافت. NPTX2 قبلاً با تخریب عصبی مرتبط بود و نقش شناخته شده ای در واسطه سیناپس های تحریکی دارد (34). به طور کلی، این نتایج انواع تغییرات پروتئین پیش بالینی مختلف را در AD نشان می دهد که به نظر می رسد با شدت بیماری پیشرفت می کند.
با توجه به اینکه در کشف پروتئوم مغز به عمق قابل توجهی از پوشش پروتئینی دست یافته ایم، در تلاش هستیم تا همپوشانی آن را با رونوشت AD در سطح شبکه به طور کامل درک کنیم. بنابراین، ما پروتئوم مغزی را که کشف کردیم با ماژولی که قبلاً از اندازه‌گیری ریزآرایه 18204 ژن در AD (n = 308) و شاهد (n = 157) بافت‌های DLPFC (13) تولید کردیم، مقایسه کردیم. همپوشانی در مجموع، ما 20 ماژول RNA مختلف را شناسایی کردیم که بسیاری از آنها غنی‌سازی انواع سلول‌های خاص، از جمله نورون‌ها، الیگودندروسیت‌ها، آستروسیت‌ها و میکروگلیا را نشان دادند (شکل 3A). تغییرات چندگانه این ماژول ها در AD در شکل 3B نشان داده شده است. مطابق با آنالیز همپوشانی پروتئین-RNA قبلی ما با استفاده از پروتئوم MS بدون برچسب عمیق تر (حدود 3000 پروتئین) (13)، بیشتر 44 ماژول در شبکه پروتئوم مغز که ما یافتیم در شبکه رونوشت وجود دارد. هیچ همپوشانی قابل توجهی وجود ندارد. کشف و تکثیر ما از 34 ماژول پروتئینی که به شدت در پروتئوم مغز حفظ شده‌اند، تنها 14 (~40%) تست دقیق فیشر (FET) را گذراندند که از نظر آماری همپوشانی معنی‌داری با رونوشت دارند (شکل 3A). سازگار با ترمیم آسیب DNA (P-M25 و P-M19)، ترجمه پروتئین (P-M7 و P-M20)، اتصال / اتصال به RNA (P-M16 و P-M21) و هدف گیری پروتئین (P-M13 و P- M23) با ماژول های موجود در رونوشت همپوشانی ندارد. بنابراین، اگرچه مجموعه داده های پروتئوم عمیق تری در تحلیل همپوشانی فعلی استفاده می شود (13)، بیشتر پروتئوم شبکه AD به شبکه رونوشت نگاشت نشده است.
(الف) FET Hypergeometric غنی‌سازی نشانگرهای نوع خاص سلول را در ماژول RNA رونوشت AD (بالا) و درجه همپوشانی بین ماژول‌های RNA (محور x) و پروتئین (محور y) مغز AD نشان می‌دهد. (پایین). شدت سایه قرمز نشان دهنده میزان غنی شدن انواع سلول در پانل بالا و شدت همپوشانی ماژول ها در پانل پایین است. ستاره ها نشان دهنده معنی داری آماری است (05/0 P<). (ب) درجه همبستگی بین ژنهای مشخصه هر ماژول رونوشت و وضعیت AD. ماژول های سمت چپ بیشترین همبستگی منفی را با AD (آبی) دارند و ماژول های سمت راست بیشترین همبستگی مثبت را با AD (قرمز) دارند. مقدار P اصلاح شده با BH تغییر شکل یافته، درجه اهمیت آماری هر همبستگی را نشان می دهد. (C) ماژول‌های همپوشانی قابل توجه با غنی‌سازی نوع سلول مشترک. (د) تجزیه و تحلیل همبستگی تغییر log2 برابر پروتئین نشاندار شده (محور x) و RNA (محور y) در ماژول همپوشانی. ضریب همبستگی پیرسون با مقدار P مربوطه نمایش داده می شود. میکرو، میکروگلیا؛ اجرام آسمانی، آستروسیت ها. سی تی، کنترل
اکثر ماژول‌های پروتئین و RNA همپوشانی پروفیل‌های غنی‌سازی سلولی مشابه و جهت‌های تغییر AD ثابت دارند (شکل 3، B و C). به عبارت دیگر، ماژول M1 مربوط به سیناپس پروتئوم مغز (PM1) به سه ماژول RNA همولوگ غنی از نورون (R-M1، R-M9 و R-M16) نگاشت می شود که در AD هر دو نشان داده شده اند. سطح کاهش یافته به طور مشابه، ماژول های پروتئین M5 و M18 غنی از گلیال با ماژول های RNA غنی از آستروسیت ها و نشانگرهای میکروگلیال (R-M3، R-M7 و R-M10) همپوشانی دارند و به شدت در افزایش بیماری ها نقش دارند. این ویژگی‌های مدولار مشترک بین دو مجموعه داده، از غنی‌سازی نوع سلول و تغییرات مرتبط با بیماری که در پروتئوم مغز مشاهده کرده‌ایم، پشتیبانی می‌کنند. با این حال، ما تفاوت های قابل توجهی بین سطوح RNA و پروتئین نشانگرهای فردی در این ماژول های مشترک مشاهده کردیم. تجزیه و تحلیل همبستگی بیان دیفرانسیل پروتئومیکس و رونویسی مولکول های درون این ماژول های همپوشانی (شکل 3D) این ناسازگاری را برجسته می کند. به عنوان مثال، APP و چندین پروتئین ماژول گلیال دیگر (NTN1، MDK، COL25A1، ICAM1، و SFRP1) افزایش قابل توجهی در پروتئوم AD نشان دادند، اما تقریباً هیچ تغییری در رونوشت AD وجود نداشت. این تغییرات خاص پروتئین ممکن است ارتباط نزدیکی با پلاک های آمیلوئید داشته باشد (23، 35)، پروتئوم را به عنوان منبع تغییرات پاتولوژیک برجسته می کند، و این تغییرات ممکن است در رونوشت منعکس نشود.
پس از تجزیه و تحلیل مستقل پروتئوم های مغز و CSF که کشف کردیم، تجزیه و تحلیل جامعی از دو مجموعه داده برای شناسایی نشانگرهای زیستی AD CSF مربوط به پاتوفیزیولوژی شبکه مغز انجام دادیم. ابتدا باید همپوشانی دو پروتئوم را تعریف کنیم. اگرچه به طور گسترده پذیرفته شده است که CSF منعکس کننده تغییرات عصبی شیمیایی در مغز AD است (4)، درجه دقیق همپوشانی بین مغز AD و پروتئوم CSF نامشخص است. با مقایسه تعداد محصولات ژن مشترک شناسایی شده در دو پروتئوم ما، دریافتیم که تقریباً 70٪ (1936 = n) از پروتئین های شناسایی شده در مایع مغزی نخاعی نیز در مغز اندازه گیری شده اند (شکل 4A). بیشتر این پروتئین‌های همپوشانی (1721=n) به یکی از 44 ماژول هم‌ابراز مجموعه داده‌های مغز اکتشاف نگاشت می‌شوند (شکل 4B). همانطور که انتظار می رفت، شش ماژول بزرگ مغز (M1 تا M6) بیشترین میزان همپوشانی CSF را نشان دادند. با این حال، ماژول‌های مغزی کوچک‌تری (مثلاً M15 و M29) وجود دارند که به طور غیرمنتظره‌ای همپوشانی بالایی دارند، بزرگ‌تر از یک ماژول مغزی دو برابر اندازه آن. این به ما انگیزه می دهد تا روشی دقیق تر و مبتنی بر آمار را برای محاسبه همپوشانی بین مغز و مایع مغزی نخاعی اتخاذ کنیم.
(الف و ب) پروتئین های کشف شده در مجموعه داده های مغز و CSF با هم همپوشانی دارند. بیشتر این پروتئین های همپوشانی با یکی از 44 ماژول هم بیانی شبکه هم بیانی مغز مرتبط هستند. (C) همپوشانی بین پروتئوم مایع مغزی نخاعی و پروتئوم شبکه مغز را کشف کنید. هر ردیف از نقشه حرارتی نشان دهنده یک تحلیل همپوشانی جداگانه از FET فوق هندسی است. ردیف بالا همپوشانی (سایه‌زنی خاکستری/سیاه) بین ماژول مغز و کل پروتئوم CSF را نشان می‌دهد. خط دوم نشان می دهد که همپوشانی بین ماژول های مغز و پروتئین CSF (به رنگ قرمز سایه دار شده است) به طور قابل توجهی در AD تنظیم می شود (P <0.05). ردیف سوم نشان می دهد که همپوشانی بین ماژول های مغز و پروتئین CSF (سایه دهی آبی) به طور قابل توجهی در AD کاهش می یابد (P <0.05). برای تصحیح مقدار P حاصل از FET از روش BH استفاده کنید. (د) پانل ماژول تاشو بر اساس ارتباط نوع سلولی و اصطلاحات GO مرتبط. این پانل ها در مجموع حاوی 271 پروتئین مرتبط با مغز هستند که بیان متفاوتی در پروتئوم CSF دارند.
با استفاده از FET های تک دم، ما اهمیت همپوشانی پروتئین بین پروتئوم CSF و ماژول های مغز را ارزیابی کردیم. تجزیه و تحلیل نشان داد که در مجموع 14 ماژول مغز در مجموعه داده‌های CSF دارای همپوشانی‌های آماری معنی‌داری هستند (P<0.05 تنظیم‌شده با FDR)، و یک ماژول اضافی (M18) که همپوشانی آن نزدیک به معنی‌داری است (P = 0.06 با FDR تنظیم شده) (شکل 4C) ، ردیف بالا). ما همچنین به ماژول هایی علاقه مند هستیم که به شدت با پروتئین های CSF بیان شده متفاوت همپوشانی دارند. بنابراین، ما دو آنالیز FET اضافی را برای تعیین اینکه کدام یک از (i) پروتئین CSF به طور قابل توجهی در AD افزایش یافت و (ii) پروتئین CSF به طور قابل توجهی در AD کاهش یافت (P <0.05، آزمون t زوجی AD / کنترل) ماژول‌های مغز با همپوشانی معنی‌دار استفاده کردیم. بین آنها همانطور که در ردیف های میانی و پایینی شکل 4C نشان داده شده است، این تجزیه و تحلیل های اضافی نشان می دهد که 8 مورد از 44 ماژول مغز به طور قابل توجهی با پروتئین اضافه شده در AD CSF (M12، M1، M2، M18، M5، M44، M33، و M38) همپوشانی دارند. . ، در حالی که تنها دو ماژول (M6 و M15) همپوشانی معنی داری با پروتئین کاهش یافته در AD CSF نشان دادند. همانطور که انتظار می رفت، تمام 10 ماژول در 15 ماژول با بیشترین همپوشانی با پروتئوم CSF قرار دارند. بنابراین، ما فرض می‌کنیم که این 15 ماژول منابع بازدهی بالا نشانگرهای زیستی CSF مشتق از مغز AD هستند.
ما این 15 ماژول همپوشانی را بر اساس نزدیکی آنها در نمودار درختی WGCNA و ارتباط آنها با انواع سلول و هستی شناسی ژن، در پنج پانل پروتئینی بزرگ قرار دادیم (شکل 4D). پانل اول شامل ماژول های غنی از نشانگرهای عصبی و پروتئین های مرتبط با سیناپس (M1 و M12) است. پانل سیناپسی در مجموع شامل 94 پروتئین است و سطوح پروتئوم CSF به طور قابل توجهی تغییر کرده است و آن را به بزرگترین منبع نشانگرهای CSF مرتبط با مغز در میان پنج پانل تبدیل کرده است. گروه دوم (M6 و M15) ارتباط نزدیک با نشانگرهای سلول های اندوتلیال و بدن عروقی، مانند "ترمیم زخم" (M6) و "تنظیم پاسخ ایمنی هومورال" (M15) را نشان دادند. M15 همچنین ارتباط زیادی با متابولیسم لیپوپروتئین دارد که ارتباط نزدیکی با اندوتلیوم دارد (36). پانل عروقی حاوی 34 نشانگر CSF مربوط به مغز است. گروه سوم شامل ماژول های (M2 و M4) است که به طور قابل توجهی با نشانگرهای الیگودندروسیت و تکثیر سلولی مرتبط هستند. برای مثال، اصطلاحات هستی شناسی سطح بالای M2 شامل "تنظیم مثبت همانندسازی DNA" و "فرایند بیوسنتز پورین" است. در همین حال، موارد M4 شامل "تمایز سلول های گلیال" و "تفکیک کروموزوم" است. پانل میلیناسیون حاوی 49 نشانگر CSF مربوط به مغز است.
گروه چهارم شامل بیشترین ماژول ها (M30، M29، M18، M24 و M5) است و تقریباً همه ماژول ها به طور قابل توجهی از نظر میکروگلیا و نشانگرهای آستروسیت غنی هستند. مشابه پانل میلیناسیون، پانل چهارم نیز شامل ماژول هایی (M30، M29 و M18) است که ارتباط نزدیکی با تکثیر سلولی دارند. ماژول های دیگر در این گروه بسیار با اصطلاحات ایمونولوژیکی مرتبط هستند، مانند "فرایند اثر ایمنی" (M5) و "تنظیم پاسخ ایمنی" (M24). گروه ایمنی گلیال حاوی 42 نشانگر CSF مربوط به مغز است. در نهایت، آخرین پانل شامل 52 نشانگر مرتبط با مغز در چهار ماژول (M44، M3، M33، و M38) است که همه آنها بر روی بدن مربوط به ذخیره انرژی و متابولیسم هستند. بزرگترین این ماژول ها (M3) ارتباط نزدیکی با میتوکندری دارد و سرشار از نشانگرهای خاص نورون است. M38 یکی از اعضای ماژول کوچکتر در این متابولوم است و همچنین ویژگی نورون متوسطی را نشان می دهد.
به طور کلی، این پنج پانل طیف گسترده ای از انواع سلول ها و عملکردها را در قشر AD منعکس می کنند و در مجموع حاوی 271 نشانگر CSF مربوط به مغز هستند (جدول S2G). به منظور ارزیابی اعتبار این نتایج MS، ما از سنجش گسترش مجاورت (PEA)، یک فناوری مبتنی بر آنتی‌بادی متعامد با قابلیت‌های مالتی پلکس، حساسیت و ویژگی بالا استفاده کردیم و نمونه‌های مایع مغزی نخاعی را که زیرمجموعه‌ای از این 271 نشانگر زیستی پیدا کردیم، دوباره تجزیه و تحلیل کردیم. (n = 36). این 36 هدف تغییر در ضریب AD PEA را نشان می‌دهند که ارتباط نزدیکی با یافته‌های مبتنی بر MS ما دارد (r = 0.87، P = 5.6 × 10-12)، که به شدت نتایج تجزیه و تحلیل جامع MS ما را تأیید می‌کند (شکل S4). ).
مضامین بیولوژیکی مورد تاکید پنج گروه ما، از سیگنال دهی سیناپسی گرفته تا متابولیسم انرژی، همگی با پاتوژنز AD مرتبط هستند (1-3). بنابراین، تمام 15 ماژول حاوی این پانل ها مربوط به آسیب شناسی AD در پروتئوم مغزی هستند که ما کشف کردیم (شکل 2B). قابل توجه ترین همبستگی پاتولوژیک مثبت بالا بین ماژول های گلیال ما و همبستگی پاتولوژیک منفی قوی بین بزرگترین ماژول های عصبی ما (M1 و M3) است. تجزیه و تحلیل بیان دیفرانسیل پروتئوم مغز تکرار شده ما (شکل S3D) همچنین پروتئین های گلیال مشتق از M5 و M18 را برجسته می کند. در AsymAD و AD علامت دار، بیشترین افزایش پروتئین گلیال و سیناپس های مرتبط با M1 پروتئین بیشتر کاهش می یابد. این مشاهدات نشان می دهد که 271 نشانگر مایع مغزی نخاعی که ما در پنج گروه شناسایی کردیم به فرآیندهای بیماری در قشر AD مربوط می شوند، از جمله آنهایی که در مراحل اولیه بدون علامت رخ می دهند.
به منظور تجزیه و تحلیل بهتر جهت تغییر پروتئین های پانل در مغز و مایع نخاعی، موارد زیر را برای هر یک از 15 ماژول همپوشانی ترسیم کردیم: (1) سطح فراوانی ماژول را در مجموعه داده های مغز پیدا کردیم و (2) ماژول را پیدا کردیم. پروتئین تفاوت در مایع مغزی نخاعی بیان می شود (شکل S5). همانطور که قبلا ذکر شد، WGCNA برای تعیین فراوانی ماژول یا مقدار پروتئین مشخصه در مغز استفاده می شود (13). نقشه آتشفشان برای توصیف بیان متفاوت پروتئین های مدولار در مایع مغزی نخاعی (AD/کنترل) استفاده می شود. این شکل ها نشان می دهد که سه پانل از پنج پانل روندهای بیان متفاوتی را در مغز و مایع نخاعی نشان می دهند. دو ماژول پانل سیناپس (M1 و M12) کاهش سطح فراوانی را در مغز AD نشان می دهند، اما به طور قابل توجهی با پروتئین افزایش یافته در AD CSF همپوشانی دارند (شکل S5A). ماژول های مرتبط با نورون حاوی متابولوم (M3 و M38) الگوهای بیان مغز و مایع مغزی نخاعی مشابهی را نشان دادند که متناقض بودند (شکل S5E). پانل عروقی نیز روندهای بیان متفاوتی را نشان داد، اگرچه ماژول‌های آن (M6 و M15) به طور متوسط ​​در مغز AD افزایش یافت و در CSF بیمار کاهش یافت (شکل S5B). دو پانل باقیمانده حاوی شبکه‌های گلیالی بزرگی هستند که پروتئین‌های آنها به طور مداوم در هر دو بخش تنظیم می‌شوند (شکل S5، C و D).
لطفاً توجه داشته باشید که این روندها برای همه نشانگرها در این پانل ها مشترک نیستند. به عنوان مثال، پانل سیناپسی شامل چندین پروتئین است که به طور قابل توجهی در مغز AD و CSF کاهش می یابد (شکل S5A). از جمله این نشانگرهای مایع مغزی نخاعی با تنظیم پایین NPTX2 و VGF از M1 و کروموگرانین B از M12 هستند. با این حال، علی‌رغم این استثناها، بیشتر نشانگرهای سیناپسی ما در مایع نخاعی AD افزایش می‌یابند. به طور کلی، این تجزیه و تحلیل‌ها قادر به تشخیص روندهای آماری معنی‌دار در سطح مایع مغزی و مغزی نخاعی در هر یک از پنج پانل ما بودند. این روندها رابطه پیچیده و اغلب متفاوت بین بیان پروتئین مغز و CSF در AD را برجسته می کند.
سپس، از آنالیز تکثیر MS با توان عملیاتی بالا (تکثیر CSF 1) استفاده کردیم تا مجموعه 271 نشانگر زیستی خود را به اهداف امیدوارکننده و قابل تکرار محدود کنیم (شکل 5A). نسخه 1 CSF شامل 96 نمونه از Emory Goizueta ADRC، از جمله گروه کنترل، AsymAD و AD (جدول S1A) است. این موارد AD با کاهش خفیف شناختی مشخص می شوند (میانگین MoCA، 3.8 ± 20.0)، و تغییرات در بیومارکرهای AD در مایع مغزی نخاعی تایید شده است (جدول S1A). برخلاف تجزیه و تحلیل CSF که ما پیدا کردیم، این تکرار با استفاده از روش MS کارآمدتر و با کارایی بالا "تک شات" (بدون تقسیم خارج از خط)، از جمله یک پروتکل آماده سازی نمونه ساده که نیاز به کاهش ایمنی نمونه های جداگانه را حذف می کند، انجام می شود. . در عوض، یک «کانال تقویت» منفرد ضعیف شده برای تقویت سیگنال پروتئین‌های کم‌تر مورد استفاده قرار می‌گیرد (37). اگرچه پوشش کل پروتئوم را کاهش می دهد، این روش تک شات به طور قابل توجهی زمان دستگاه را کاهش می دهد و تعداد نمونه های برچسب گذاری شده با TMT را افزایش می دهد که می توانند قابل تجزیه و تحلیل باشند (17، 38). در مجموع، آنالیز 6487 پپتید را شناسایی کرد که در 96 مورد به 1183 پروتئوم نشان داده شد. همانند آنالیز CSF که دریافتیم، فقط پروتئین‌هایی که در حداقل 50 درصد نمونه‌ها کمیت شده بودند، در محاسبات بعدی گنجانده شدند و داده‌ها برای اثرات سن و جنسیت پسرفت شدند. این منجر به تعیین کمیت نهایی 792 پروتئوم شد که 95 درصد آن ها نیز در مجموعه داده های CSF یافت شده شناسایی شدند.
(الف) اهداف پروتئین CSF مرتبط با مغز در اولین گروه CSF تکرار شده تأیید شده و در پانل نهایی گنجانده شده است (60 = n). (B تا E) سطوح بیومارکر پانل (نمرات z مرکب) در چهار گروه تکرار CSF اندازه‌گیری شد. برای ارزیابی اهمیت آماری تغییرات فراوانی در هر آنالیز تکراری از آزمون‌های t زوجی یا ANOVA با تصحیح پس از توکی استفاده شد. سی تی، کنترل
از آنجایی که ما به طور خاص علاقه مند به تأیید 271 هدف CSF مرتبط با مغز خود از طریق تجزیه و تحلیل جامع هستیم، بررسی بیشتر این پروتئوم تکرار شده را به این نشانگرها محدود خواهیم کرد. از بین این 271 پروتئین، 100 پروتئین در تکثیر CSF 1 شناسایی شدند. شکل S6A بیان دیفرانسیل این 100 نشانگر همپوشانی بین نمونه های شاهد و تکرار AD را نشان می دهد. هیستون های سیناپسی و متابولیت در AD بیشترین افزایش را دارند، در حالی که پروتئین های عروقی بیشترین کاهش را در بیماری دارند. اکثر 100 نشانگر همپوشانی (70=n) جهت تغییر را در دو مجموعه داده حفظ کردند (شکل S6B). این 70 نشانگر CSF مرتبط با مغز تایید شده (جدول S2H) تا حد زیادی منعکس کننده روندهای بیان پانل مشاهده شده قبلی است، یعنی تنظیم پایین پروتئین های عروقی و تنظیم بالا در تمام پانل های دیگر. تنها 10 مورد از این 70 پروتئین تایید شده تغییراتی را در فراوانی AD نشان دادند که با این روندهای پانل تناقض داشت. به منظور تولید پانلی که روند کلی مغز و مایع مغزی نخاعی را به بهترین نحو منعکس کند، ما این 10 پروتئین را از پانل مورد علاقه که در نهایت تأیید کردیم حذف کردیم (شکل 5A). بنابراین، پانل ما در نهایت شامل 60 پروتئین است که در دو گروه مستقل CSF AD با استفاده از آماده‌سازی نمونه‌های مختلف و آنالیز پلت فرم MS تأیید شده‌اند. نمودارهای بیان امتیاز z این پانل های نهایی در موارد کنترل CSF کپی 1 و موارد AD روند پانل مشاهده شده در گروه CSF را که ما پیدا کردیم تایید کرد (شکل 5B).
در میان این 60 پروتئین، مولکول‌هایی وجود دارند که با AD مرتبط هستند، مانند استئوپونتین (SPP1)، که یک سایتوکین پیش‌التهابی است که در بسیاری از مطالعات با AD مرتبط بوده است (39-41)، و GAP43، یک پروتئین سیناپسی. که به وضوح با تخریب عصبی مرتبط است (42). پروتئین‌های کاملاً تأیید شده نشانگرهای مربوط به سایر بیماری‌های تخریب‌کننده عصبی، مانند اسکلروز جانبی آمیوتروفیک (ALS) مربوط به سوپراکسید دیسموتاز 1 (SOD1) و دساکاراز مرتبط با بیماری پارکینسون (PARK7) هستند. ما همچنین تأیید کرده‌ایم که بسیاری از نشانگرهای دیگر، مانند SMOC1 و پروتئین سیگنال‌دهنده اتصال غشایی غنی از مغز 1 (BASP1)، پیوندهای قبلی را با تخریب عصبی محدود کرده‌اند. شایان ذکر است که به دلیل فراوانی کلی کم آنها در پروتئوم CSF، استفاده از این روش تشخیص تک شات با توان بالا برای شناسایی مطمئن MAPT و برخی دیگر از پروتئین های مرتبط با AD (به عنوان مثال، NEFL و NRGN) برای ما دشوار است. ) (43 و 44).
سپس این 60 نشانگر پانل اولویت را در سه تجزیه و تحلیل تکراری دیگر بررسی کردیم. در نسخه 2 CSF، ما از یک TMT-MS برای تجزیه و تحلیل یک گروه مستقل از 297 نمونه شاهد و AD از Emory Goizueta ADRC استفاده کردیم (17). تکرار CSF 3 شامل تجزیه و تحلیل مجدد داده های TMT-MS موجود از 120 بیمار کنترل و AD از لوزان، سوئیس بود (45). ما بیش از دو سوم از 60 نشانگر اولویت را در هر مجموعه داده شناسایی کردیم. اگرچه مطالعه سوئیسی از پلتفرم‌های مختلف MS و روش‌های کمی‌سازی TMT استفاده کرد (45، 46)، ما به شدت روندهای پانل خود را در دو تحلیل مکرر (شکل 5، C و D، و جداول S2، I و J) بازتولید کردیم. برای ارزیابی ویژگی بیماری گروه ما، ما از TMT-MS برای تجزیه و تحلیل مجموعه داده های تکرار چهارم (تکثیر CSF 4) استفاده کردیم که نه تنها شامل شاهد (18 = n) و AD (n = 17) موارد، بلکه همچنین PD ( n = 14))، ALS (n = 18) و دمانس فرونتومپورال (FTD) (11 = n) (جدول S1A). ما تقریباً دو سوم پروتئین‌های پانل را در این گروه (38 از 60) با موفقیت اندازه‌گیری کردیم. این نتایج تغییرات خاص AD را در هر پنج پانل نشانگر زیستی برجسته می کند (شکل 5E و جدول S2K). افزایش در گروه متابولیت قوی ترین ویژگی AD را نشان داد و پس از آن گروه میلین و گلیال قرار گرفتند. به میزان کمتر، FTD همچنین افزایشی را بین این پانل ها نشان می دهد که ممکن است منعکس کننده تغییرات بالقوه مشابه در شبکه باشد (17). در مقابل، ALS و PD تقریباً نمایه های میلیناسیون، گلیال و متابولوم مشابه گروه کنترل را نشان دادند. به طور کلی، علی‌رغم تفاوت‌ها در آماده‌سازی نمونه، پلت فرم MS و روش‌های کمی‌سازی TMT، این تجزیه و تحلیل‌های مکرر نشان می‌دهد که نشانگرهای پانل اولویت ما در بیش از 500 نمونه CSF منحصربه‌فرد دارای تغییرات بسیار سازگار با AD هستند.
تخریب عصبی AD چندین سال قبل از شروع علائم شناختی به طور گسترده شناخته شده است، بنابراین نیاز فوری به نشانگرهای زیستی AsymAD وجود دارد (5، 31). با این حال، شواهد بیشتر و بیشتر نشان می دهد که زیست شناسی AsymAD از همگن فاصله زیادی دارد، و تعامل پیچیده ریسک و انعطاف پذیری منجر به تفاوت های فردی بزرگ در پیشرفت بیماری بعدی می شود (47). اگرچه برای شناسایی موارد AsymAD استفاده می شود، اما سطوح بیومارکرهای زیستی CSF مرکزی (Aβ1-42، تاو تاو و p-tau) به طور قابل اعتمادی قادر به پیش بینی اینکه چه کسی به سمت زوال عقل پیشرفت می کند، ثابت نشده است (4، 7)، که نشان می دهد ممکن است بیشتر باشد. برای طبقه بندی دقیق خطر این جمعیت، باید ابزارهای نشانگر زیستی کل نگر بر اساس جنبه های متعدد فیزیولوژی مغز گنجانده شود. بنابراین، ما متعاقباً پانل نشانگر زیستی تأیید شده با AD خود را در جمعیت AsymAD نسخه 1 CSF تجزیه و تحلیل کردیم. این 31 مورد AsymAD سطوح بیومارکر هسته غیرطبیعی (نسبت Aβ1-42/total tau ELISA، <5.5) و شناخت کامل (میانگین MoCA، 271) را نشان دادند. 2.2 ±) (جدول S1A). علاوه بر این، همه افراد مبتلا به AsymAD دارای نمره زوال عقل بالینی 0 هستند، که نشان می دهد هیچ مدرکی دال بر کاهش عملکرد شناختی یا عملکردی روزانه وجود ندارد.
ما ابتدا سطوح پانل های تایید شده را در همه 96 تکرار CSF 1، از جمله گروه AsymAD تجزیه و تحلیل کردیم. ما دریافتیم که چندین پانل در گروه AsymAD تغییرات فراوانی قابل توجهی شبیه AD داشتند، پانل عروقی روند نزولی را در AsymAD نشان داد، در حالی که همه پانل‌های دیگر روند صعودی را نشان دادند (شکل 6A). بنابراین، همه پانل ها ارتباط بسیار معنی داری با ELISA Aβ1-42 و سطوح تاو کل نشان دادند (شکل 6B). در مقابل، همبستگی بین گروه و نمره MoCA نسبتا ضعیف است. یکی از برجسته‌ترین یافته‌های این تحلیل‌ها، گستره وسیعی از فراوانی پانل در گروه AsymAD است. همانطور که در شکل 6 الف نشان داده شده است، سطح پانل گروه AsymAD معمولاً از سطح پانل گروه کنترل و گروه AD عبور می کند و تنوع نسبتاً بالایی را نشان می دهد. برای بررسی بیشتر این ناهمگونی AsymAD، ما آنالیز مقیاس‌گذاری چند بعدی (MDS) را در 96 مورد CSF تکرار 1 اعمال کردیم. تجزیه و تحلیل MDS امکان تجسم شباهت بین موارد را بر اساس متغیرهای خاصی در مجموعه داده ها فراهم می کند. برای این تجزیه و تحلیل خوشه‌ای، ما فقط از آن دسته از نشانگرهای پانل معتبر استفاده می‌کنیم که از نظر آماری تغییر معنی‌داری دارند (P <0.05، AD/کنترل) در سطح کشف CSF و تکرار 1 پروتئوم (n = 29) (جدول S2L). این تجزیه و تحلیل خوشه بندی فضایی واضحی را بین موارد کنترل ما و موارد AD ایجاد کرد (شکل 6C). در مقابل، برخی از موارد AsymAD به وضوح در گروه کنترل دسته بندی می شوند، در حالی که برخی دیگر در موارد AD قرار دارند. برای بررسی بیشتر این ناهمگونی AsymAD، از نقشه MDS خود برای تعریف دو گروه از این موارد AsymAD استفاده کردیم. گروه اول شامل موارد AsymAD بود که به گروه کنترل نزدیک‌تر بودند (19=n)، در حالی که گروه دوم با موارد AsymAD با نمایه نشانگر نزدیک‌تر به AD مشخص شد (12=n).
(الف) سطح بیان (امتیاز z) گروه بیومارکر CSF در همه 96 نمونه در گروه تکرار CSF 1، از جمله AsymAD. برای ارزیابی اهمیت آماری تغییرات فراوانی پانل از تحلیل واریانس با تصحیح پس از توکی استفاده شد. (B) تجزیه و تحلیل همبستگی سطح فراوانی پروتئین پانل (z-score) با نمره MoCA و سطح تاو کل در نمونه‌های ELISA Aβ1-42 و CSF نسخه 1. ضریب همبستگی پیرسون با مقدار P مربوطه نمایش داده می شود. (C) MDS 96 مورد نسخه 1 CSF بر اساس سطوح فراوانی 29 نشانگر پانل معتبر بود که به طور قابل توجهی در مجموعه داده های کشف و کپی CSF 1 تغییر کرد [P <0.05 AD/Control (CT)]. این تجزیه و تحلیل برای تقسیم گروه AsymAD به زیر گروه های کنترل (19 = n) و AD (12 = n) مورد استفاده قرار گرفت. (D) نمودار آتشفشان بیان دیفرانسیل همه پروتئین‌های تکثیر 1 CSF را با تغییر برابر log2 (محور x) نسبت به مقدار P آماری -log10 بین دو زیر گروه AsymAD نشان می‌دهد. بیومارکرهای پانل رنگی هستند. (E) سطح فراوانی تکثیر CSF 1 بیومارکرهای گروه انتخابی به طور متفاوتی بین زیر گروه‌های AsymAD بیان می‌شود. برای ارزیابی معنی‌داری آماری از تحلیل واریانس تعدیل‌شده توکی استفاده شد.
ما بیان پروتئین افتراقی بین این موارد کنترل و موارد AsymAD شبه AD را بررسی کردیم (شکل 6D و جدول S2L). نقشه آتشفشان حاصل نشان می دهد که 14 نشانگر پانل به طور قابل توجهی بین دو گروه تغییر کرده است. بیشتر این نشانگرها اعضای سیناپس و متابولوم هستند. با این حال، SOD1 و سوبسترای پروتئین کیناز C غنی از آلانین میریستویله (MARCKS) که به ترتیب اعضای گروه ایمنی میلین و گلیال هستند نیز به این گروه تعلق دارند (شکل 6، D و E). پانل عروقی همچنین دارای دو نشانگر بود که به طور قابل توجهی در گروه AsymAD شبه AD کاهش یافت، از جمله پروتئین اتصال دهنده AE 1 (AEBP1) و عضو خانواده مکمل C9. تفاوت معنی داری بین زیرگروه AsymAD کنترل و شبه AD در ELISA AB1-42 (P = 0.38) و p-tau (P = 0.28) وجود نداشت، اما در واقع تفاوت معنی داری در سطح تاو کل وجود داشت (0.0031 = P ) (شکل S7). نشانگرهای پانل متعددی وجود دارد که نشان می دهد تغییرات بین دو زیر گروه AsymAD نسبت به سطح کل تاو (به عنوان مثال YWHAZ، SOD1 و MDH1) قابل توجه تر است (شکل 6E). به طور کلی، این نتایج نشان می‌دهد که پانل معتبر ما ممکن است حاوی نشانگرهای زیستی باشد که می‌توانند زیرشاخه‌بندی و طبقه‌بندی خطر بالقوه بیماران مبتلا به بیماری بدون علامت را داشته باشند.
نیاز فوری به ابزارهای نشانگر زیستی مبتنی بر سیستم برای اندازه گیری و هدف قرار دادن بهتر پاتوفیزیولوژی های مختلف پشت AD وجود دارد. انتظار می رود این ابزارها نه تنها چارچوب تشخیصی AD ما را تغییر دهند، بلکه اتخاذ استراتژی های درمانی مؤثر و خاص بیمار را نیز ارتقا دهند (1، 2). برای این منظور، ما یک رویکرد پروتئومیکس جامع بی‌طرفانه را برای AD و CSF به کار بردیم تا نشانگرهای زیستی CSF مبتنی بر وب را شناسایی کنیم که طیف وسیعی از پاتوفیزیولوژی مبتنی بر مغز را منعکس می‌کنند. تجزیه و تحلیل ما پنج پانل نشانگر زیستی CSF را تولید کرد که (i) منعکس کننده سیناپس ها، رگ های خونی، میلین، اختلالات ایمنی و متابولیک هستند. (ب) نشان دادن تکرارپذیری قوی در سیستم عامل های مختلف MS. (iii) تغییرات پیشرونده خاص بیماری را در مراحل اولیه و اواخر AD نشان دهید. به طور کلی، این یافته ها گامی امیدوارکننده به سمت توسعه ابزارهای نشانگر زیستی متنوع، قابل اعتماد و مبتنی بر وب برای تحقیقات AD و کاربردهای بالینی است.
نتایج ما سازماندهی بسیار حفاظت شده پروتئوم شبکه مغز AD را نشان می دهد و از استفاده از آن به عنوان لنگر برای توسعه نشانگرهای زیستی مبتنی بر سیستم پشتیبانی می کند. تجزیه و تحلیل ما نشان می دهد که دو مجموعه داده مستقل TMT-MS حاوی مغزهای AD و AsymAD دارای ماژولار قوی هستند. این یافته‌ها کار قبلی ما را گسترش می‌دهند و حفظ ماژول‌های قدرتمند بیش از 2000 بافت مغز از گروه‌های مستقل متعدد در قشر پیشانی، جداری و گیجگاهی را نشان می‌دهند (17). این شبکه اجماع منعکس کننده تغییرات مختلف مرتبط با بیماری است که در تحقیقات فعلی مشاهده شده است، از جمله افزایش ماژول های التهابی غنی از گلیال و کاهش ماژول های غنی از نورون. مانند تحقیقات فعلی، این شبکه در مقیاس بزرگ همچنین دارای تغییرات مدولار قابل توجهی در AsymAD است که انواع مختلف پاتوفیزیولوژی پیش بالینی را نشان می دهد (17).
با این حال، در این چارچوب مبتنی بر سیستم بسیار محافظه کارانه، ناهمگونی بیولوژیکی دقیق تری وجود دارد، به ویژه در میان افراد در مراحل اولیه AD. پانل نشانگر زیستی ما قادر است دو زیر گروه را در AsymAD به تصویر بکشد، که بیان تفاوت قابل توجه نشانگرهای CSF متعدد را نشان می دهد. گروه ما توانست تفاوت های بیولوژیکی بین این دو زیر گروه را برجسته کند، که در سطح نشانگرهای زیستی هسته AD آشکار نبود. در مقایسه با گروه کنترل، نسبت Aβ1-42/tau کل این افراد AsymAD به طور غیر طبیعی پایین بود. با این حال، تنها سطح کل تاو به طور قابل توجهی بین دو زیر گروه AsymAD متفاوت بود، در حالی که سطوح Aβ1-42 و p-tau نسبتاً قابل مقایسه باقی ماندند. از آنجایی که به نظر می رسد تائو بالای CSF نسبت به سطوح Aβ1-42 پیش بینی کننده بهتری برای علائم شناختی باشد (7)، ما گمان می کنیم که دو گروه AsymAD ممکن است خطرات متفاوتی برای پیشرفت بیماری داشته باشند. با توجه به حجم نمونه محدود AsymAD ما و فقدان داده های طولی، تحقیقات بیشتری برای نتیجه گیری مطمئن این نتایج مورد نیاز است. با این حال، این نتایج نشان می دهد که یک پانل CSF مبتنی بر سیستم می تواند توانایی ما را برای طبقه بندی موثر افراد در مرحله بدون علامت بیماری افزایش دهد.
به طور کلی، یافته های ما از نقش عملکردهای بیولوژیکی متعدد در پاتوژنز AD پشتیبانی می کند. با این حال، متابولیسم انرژی نامنظم به موضوع برجسته همه پنج پانل برچسب‌گذاری معتبر ما تبدیل شد. پروتئین‌های متابولیک، مانند هیپوگزانتین-گوانین فسفریبوزیل ترانسفراز 1 (HPRT1) و لاکتات دهیدروژناز A (LDHA)، قوی‌ترین نشانگرهای زیستی سیناپسی هستند که نشان می‌دهند افزایش AD CSF جنسیت بسیار قابل تکرار است. رگ‌های خونی و پانل‌های گلیال ما نیز حاوی چندین نشانگر هستند که در متابولیسم مواد اکسیداتیو نقش دارند. این یافته‌ها با نقش کلیدی که فرآیندهای متابولیک در کل مغز ایفا می‌کنند، نه تنها برای برآوردن نیاز انرژی بالای نورون‌ها، بلکه برای برآوردن نیاز انرژی بالای آستروسیت‌ها و سایر سلول‌های گلیال همخوانی دارد (17، 48). نتایج ما از شواهد رو به رشدی حمایت می کند که تغییرات در پتانسیل ردوکس و وقفه در مسیرهای انرژی ممکن است پیوند اصلی بین چندین فرآیند کلیدی درگیر در پاتوژنز AD، از جمله اختلالات میتوکندری، التهاب با واسطه گلیال، و آسیب عروقی باشد (49). علاوه بر این، نشانگرهای زیستی مایع مغزی نخاعی متابولیک حاوی تعداد زیادی پروتئین غنی متفاوت بین گروه‌های کنترل ما و زیرگروه‌های AsymAD شبه AD هستند که نشان می‌دهد اختلال در این مسیرهای انرژی و ردوکس ممکن است در مرحله پیش بالینی بیماری حیاتی باشد.
روندهای مختلف مغز و مایع مغزی نخاعی که ما مشاهده کرده‌ایم پیامدهای بیولوژیکی جالبی نیز دارند. سیناپس ها و متابولوم های غنی از نورون ها سطوح کاهش یافته در مغز AD و افزایش فراوانی در مایع مغزی نخاعی را نشان می دهند. با توجه به اینکه نورون‌ها غنی از میتوکندری‌های تولیدکننده انرژی در سیناپس‌ها هستند تا انرژی سیگنال‌های تخصصی متعدد خود را تامین کنند (50)، شباهت پروفایل‌های بیان این دو گروه عصبی مورد انتظار است. از دست دادن نورون ها و بیرون راندن سلول های آسیب دیده می تواند این روندهای پانل مغز و CSF را در بیماری بعدی توضیح دهد، اما آنها نمی توانند تغییرات پانل اولیه را که مشاهده می کنیم توضیح دهند (13). یک توضیح احتمالی برای این یافته ها در بیماری های بدون علامت اولیه، هرس سیناپسی غیر طبیعی است. شواهد جدید در مدل های موش نشان می دهد که فاگوسیتوز سیناپسی با واسطه میکروگلیا ممکن است به طور غیر طبیعی در AD فعال شود و منجر به از دست دادن زودرس سیناپس در مغز شود (51). این ماده سیناپسی دور ریخته شده ممکن است در CSF جمع شود، به همین دلیل است که ما افزایش CSF را در پانل نورون مشاهده می کنیم. هرس سیناپسی با واسطه ایمنی ممکن است تا حدی افزایش پروتئین های گلیال را که در مغز و مایع مغزی نخاعی در طول فرآیند بیماری مشاهده می کنیم توضیح دهد. علاوه بر هرس سیناپسی، ناهنجاری‌های کلی در مسیر اگزوسیتی ممکن است به بیان متفاوت نشانگرهای عصبی مغز و CSF منجر شود. تعدادی از مطالعات نشان داده اند که محتوای اگزوزوم ها در پاتوژنز مغز AD تغییر کرده است (52). مسیر خارج سلولی نیز در تکثیر Aβ نقش دارد (53، 54). شایان ذکر است که سرکوب ترشح اگزوزومی ممکن است آسیب شناسی شبه AD را در مدل های موش تراریخته AD کاهش دهد (55).
در همان زمان، پروتئین در پانل عروقی افزایش متوسطی را در مغز AD نشان داد، اما به طور قابل توجهی در CSF کاهش یافت. اختلال عملکرد سد خونی مغزی (BBB) ​​تا حدی می تواند این یافته ها را توضیح دهد. بسیاری از مطالعات مستقل پس از مرگ انسان، تجزیه BBB را در AD نشان داده اند (56، 57). این مطالعات فعالیت‌های غیرعادی مختلفی را در اطراف این لایه محکم بسته شده از سلول‌های اندوتلیال، از جمله نشت مویرگی مغز و تجمع پروتئین‌های منتقله از خون در اطراف عروق تأیید کردند (57). این می‌تواند توضیح ساده‌ای برای افزایش پروتئین‌های عروقی در مغز ارائه دهد، اما نمی‌تواند به طور کامل تخلیه این پروتئین‌ها در مایع مغزی نخاعی را توضیح دهد. یک احتمال این است که سیستم عصبی مرکزی به طور فعال این مولکول ها را برای حل مشکل افزایش التهاب و استرس اکسیداتیو جدا می کند. کاهش برخی از شدیدترین پروتئین‌های CSF در این پانل، به ویژه آنهایی که در تنظیم لیپوپروتئین نقش دارند، به مهار سطوح مضر التهاب و فرآیند محافظت عصبی گونه‌های فعال اکسیژن مربوط می‌شود. این در مورد پاروکسوناز 1 (PON1)، یک آنزیم اتصال لیپوپروتئینی که مسئول کاهش سطح استرس اکسیداتیو در گردش خون است، صادق است (58، 59). پیش ساز آلفا-1-میکروگلوبولین/بیکونین (AMBP) یکی دیگر از نشانگرهای کاهش قابل توجهی در گروه عروقی است. این پیش ساز بیکونین ناقل لیپید است که در سرکوب التهاب و محافظت عصبی نیز نقش دارد (60، 61).
علی‌رغم فرضیه‌های مختلف جالب، ناتوانی در تشخیص مستقیم مکانیسم‌های بیماری بیوشیمیایی یک محدودیت شناخته شده در تجزیه و تحلیل پروتئومیکس مبتنی بر کشف است. بنابراین، تحقیقات بیشتر برای تعریف مطمئن مکانیسم های پشت این پانل های نشانگر زیستی ضروری است. به منظور حرکت به سمت توسعه تجزیه و تحلیل بالینی مبتنی بر MS، جهت آینده همچنین مستلزم استفاده از روش های کمی هدفمند برای تأیید بیومارکر در مقیاس بزرگ، مانند نظارت بر واکنش انتخابی یا موازی است (62). ما اخیراً از نظارت بر واکنش موازی (63) برای تأیید اعتبار بسیاری از تغییرات پروتئین CSF که در اینجا توضیح داده شده است استفاده کردیم. چندین هدف پانل اولویت با دقت قابل توجهی اندازه‌گیری می‌شوند، از جمله YWHAZ، ALDOA و SMOC1 که به ترتیب به پانل‌های سیناپس، متابولیسم و ​​التهاب ما نقشه می‌دهند (63). کسب اطلاعات مستقل (DIA) و سایر استراتژی‌های مبتنی بر MS نیز ممکن است برای تأیید هدف مفید باشند. بود و همکاران (64) اخیراً نشان داده شده است که همپوشانی قابل توجهی بین نشانگرهای زیستی AD شناسایی شده در مجموعه داده های کشف CSF ما و مجموعه داده های مستقل DIA-MS وجود دارد که از نزدیک به 200 نمونه CSF از سه گروه مختلف اروپایی تشکیل شده است. این مطالعات اخیر از پتانسیل پانل های ما برای تبدیل به تشخیص قابل اعتماد مبتنی بر MS پشتیبانی می کند. تشخیص سنتی مبتنی بر آنتی بادی و آپتامر نیز برای توسعه بیشتر بیومارکرهای کلیدی AD مهم است. با توجه به فراوانی کم CSF، تشخیص این نشانگرهای زیستی با استفاده از روش‌های پرتوان MS دشوارتر است. NEFL و NRGN دو نمونه از بیومارکرهای زیستی CSF با فراوانی کم هستند که در تجزیه و تحلیل جامع ما به پانل نگاشت شده‌اند، اما با استفاده از استراتژی MS واحد ما نمی‌توان آنها را به‌طور قابل اعتماد شناسایی کرد. استراتژی‌های هدف‌گیری مبتنی بر آنتی‌بادی‌های متعدد، مانند PEA، ممکن است تبدیل بالینی این نشانگرها را تقویت کند.
به طور کلی، این مطالعه یک رویکرد پروتئومیکس منحصر به فرد برای شناسایی و تأیید بیومارکرهای AD CSF بر اساس سیستم های مختلف ارائه می دهد. بهینه‌سازی این پانل‌های نشانگر در میان گروه‌های دیگر AD و پلتفرم‌های MS ممکن است برای پیشبرد طبقه‌بندی و درمان خطر AD امیدوارکننده باشد. مطالعاتی که سطح طولی این پانل‌ها را در طول زمان ارزیابی می‌کنند نیز برای تعیین اینکه کدام ترکیب از نشانگرها خطر ابتلا به بیماری اولیه و تغییرات در شدت بیماری را به بهترین نحو طبقه‌بندی می‌کنند، حیاتی هستند.
به جز 3 نمونه کپی شده توسط CSF، تمام نمونه های CSF مورد استفاده در این مطالعه تحت نظارت Emory ADRC یا موسسات تحقیقاتی نزدیک جمع آوری شدند. در مجموع چهار مجموعه از نمونه های CSF Emory در این مطالعات پروتئومیکس استفاده شد. گروه CSF حاوی نمونه‌هایی از 20 فرد سالم و 20 بیمار مبتلا به AD بود. نسخه 1 CSF شامل نمونه هایی از 32 فرد سالم، 31 فرد AsymAD و 33 فرد AD است. نسخه 2 CSF شامل 147 کنترل و 150 نمونه پس از میلاد است. همگروهی 4 تکرار CSF چند بیماری شامل 18 شاهد، 17 پس از میلاد، 19 ALS، 13 PD، و 11 نمونه FTD بود. بر اساس توافق نامه ای که توسط هیئت بررسی نهادی دانشگاه اموری تایید شده است، همه شرکت کنندگان در مطالعه Emory رضایت آگاهانه را کسب کردند. بر اساس دستورالعمل‌های بهترین عملکرد موسسه ملی پیری در سال 2014 برای مراکز آلزایمر (https://alz.washington.edu/BiospecimenTaskForce.html)، مایع مغزی نخاعی با پونکسیون کمری جمع‌آوری و ذخیره شد. بیماران کنترل و AsymAD و AD ارزیابی شناختی استاندارد شده را در کلینیک عصب شناختی Emory یا Goizueta ADRC دریافت کردند. نمونه‌های مایع مغزی نخاعی آنها توسط INNO-BIA AlzBio3 Luminex برای آنالیز ELISA Aβ1-42، تاو کل و P-tau مورد آزمایش قرار گرفت (65). مقادیر ELISA برای حمایت از طبقه بندی تشخیصی افراد بر اساس معیارهای قطع نشانگر زیستی AD استفاده می شود (66، 67). داده های اولیه جمعیت شناختی و تشخیصی برای سایر تشخیص های CSF (FTD، ALS، و PD) نیز از Emory ADRC یا مؤسسات تحقیقاتی وابسته به دست می آیند. فراداده خلاصه مورد برای این موارد CSF Emory را می توان در جدول S1A یافت. ویژگی های گروه تکرار 3 CSF سوئیس قبلاً منتشر شده است (45).
CSF نمونه را پیدا کرد. به منظور افزایش عمق کشف مجموعه داده‌های CSF، مصرف ایمنی پروتئین‌های با فراوانی بالا قبل از تریپسینیزاسیون انجام شد. به طور خلاصه، 130 میکرولیتر CSF از 40 نمونه CSF منفرد و حجم مساوی (130 میکرولیتر) از رزین کاهش پروتئین فراوان بالای 14 بالا (Thermo Fisher Scientific, A36372) در یک ستون چرخشی (Thermo Fisher Scientific, A89868) در اتاق قرار داده شد. دما جوجه کشی). پس از چرخش به مدت 15 دقیقه، نمونه را در 1000 گرم به مدت 2 دقیقه سانتریفیوژ کنید. یک دستگاه فیلتر اولتراسانتریفیوژ 3K (Millipor, UFC500396) برای تغلیظ نمونه پساب با سانتریفیوژ کردن در 14000 گرم به مدت 30 دقیقه استفاده شد. تمام حجم های نمونه را با سالین بافر فسفات تا 75 میکرولیتر رقیق کنید. غلظت پروتئین با روش بیسینکونیک اسید (BCA) طبق پروتکل سازنده (Thermo Fisher Scientific) ارزیابی شد. CSF نقص ایمنی (60 میکرولیتر) از تمام 40 نمونه با لیزیل اندوپپتیداز (LysC) و تریپسین هضم شد. به طور خلاصه، نمونه با 1.2 میکرولیتر 0.5 مولار tris-2(-carboxyethyl)-phosphine و 3 μl 0.8 M chloroacetamide در دمای 90 درجه سانتی گراد به مدت 10 دقیقه آلکیله شد و سپس به مدت 15 دقیقه در حمام آب فراصوت شد. نمونه با 193 میکرولیتر بافر اوره 8 مولار [8 مولار اوره و 100 میلی مولار NaHPO4 (pH 5/8)] تا غلظت نهایی 6 مولار اوره رقیق شد. LysC (4.5 میکروگرم؛ Wako) برای هضم شبانه در دمای اتاق استفاده می شود. سپس نمونه به 1 مولار اوره با 50 میلی مولار بی کربنات آمونیوم (ABC) رقیق شد (68). مقدار مساوی (4.5 میکروگرم) تریپسین (Promega) را اضافه کنید و سپس نمونه را به مدت 12 ساعت انکوبه کنید. محلول پپتید هضم شده را به غلظت نهایی 1% اسید فرمیک (FA) و 0.1% تری فلوئورواستیک اسید (TFA) اسیدی کنید (66) و سپس با ستون 50 میلی گرم Sep-Pak C18 (Waters) همانطور که در بالا توضیح داده شد نمک زدایی کنید (25). . سپس پپتید در 1 میلی لیتر استونیتریل 50 درصد (ACN) شسته شد. برای استاندارد کردن کمیت پروتئین در دسته ها (25)، مقدار 100 میکرولیتر از تمام 40 نمونه CSF برای تولید یک نمونه ترکیبی ترکیب شد، که سپس به پنج نمونه استاندارد داخلی جهانی (GIS) (48) تقسیم شد. تمام نمونه های جداگانه و استانداردهای ترکیبی توسط خلاء پرسرعت (Labconco) خشک می شوند.
CSF نمونه را کپی می کند. دایون و همکارانش قبلاً کاهش سیستم ایمنی و هضم نمونه‌های کپی 3 CSF را توصیف کرده‌اند (45، 46). نمونه‌های تکراری باقی‌مانده به‌صورت جداگانه نقص ایمنی نداشتند. این نمونه های حذف نشده را همانطور که قبلا توضیح داده شد در تریپسین هضم کنید (17). برای هر تجزیه و تحلیل مکرر، مقدار 120 میکرولیتر از پپتید شسته شده از هر نمونه با هم ادغام شد و به مقادیر مساوی تقسیم شد تا به عنوان استاندارد داخلی جهانی با برچسب TMT استفاده شود (48). تمام نمونه های جداگانه و استانداردهای ترکیبی توسط خلاء پرسرعت (Labconco) خشک می شوند. به منظور تقویت سیگنال پروتئین CSF با فراوانی کم، با ترکیب 125 میکرولیتر از هر نمونه، یک نمونه "بهبود یافته" برای هر آنالیز تکراری تهیه شد [یعنی یک نمونه بیولوژیکی که نمونه تحقیق را تقلید می کند، اما مقدار موجود آن است. بسیار بزرگتر (37، 69)] در یک نمونه مخلوط CSF ادغام شدند (17). نمونه مخلوط سپس با استفاده از 12 میلی‌لیتر رزین حذف پروتئین با فراوانی High Select Top14 (Thermo Fisher Scientific, A36372)، هضم شد و همانطور که در بالا توضیح داده شد، هضم شد و در برچسب‌گذاری چندگانه TMT بعدی گنجانده شد.